细胞焦亡与肺动脉高压的关系及治疗肺动脉高压药物研究进展

颜 倩,孙 洋,龙俊鹏,刘莎莎,姚 娇,林玉婷,阳松威,杨岩涛,裴 刚,艾启迪,陈乃宏,4

(1. 湖南中医药大学药学院,2. 湖南省中药饮片标准化及功能工程技术研究中心,湖南 长沙 410208;3. 湘潭市中心医院,湖南 湘潭 411199;4. 中国医学科学院药物研究所,北京协和医学院药物研究所,北京 100050)

细胞焦亡作为伴有炎症反应的程序性细胞死亡方式,炎性体传感器识别多种病原体和损伤相关分子模式,推动了caspase-1或4/5/11的激活,它们裂解gasdermin-D,分离N端成孔结构域(pore-forming domain,PFD)和C端抑制结构域(repressor domain,RD)。而后PFD在膜中形成大孔,驱动细胞膜膨胀和破裂。大量研究证据表明,细胞焦亡参与影响PAH的发生发展,抑制细胞焦亡可以缓解PAH疾病的严重程度。

1 细胞焦亡

1.1 细胞焦亡的发展历史最早对细胞焦亡的研究可以追溯到1986年。Friedlander指出用炭疽致死毒素(LT)处理原代小鼠巨噬细胞,可导致细胞死亡和内容物的快速释放。1992年,Zychlinsky等通过观察在革兰阴性细菌病原体福氏志贺氏菌感染的巨噬细胞中发现的自杀现象,首次发现细胞焦亡。这种某些过程和特征与凋亡相似的细胞死亡形式,最初被认为是细胞凋亡。2001年,D′Souza等提出“细胞焦亡”一词,用于描述促炎性程序性细胞死亡,使细胞焦亡和细胞凋亡(细胞非炎性死亡程序)区分开来。2002年,Martinon等首次提出炎症小体可以加工白细胞介素1β(interleukin,IL-1β)及激活炎症性半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)。在2012年,Peter Broz等指出在不需要caspase-1的情况下,非经典caspase-11途径也能增加沙门菌的感染率。2017年研究者发现细胞焦亡可由caspase-1或者caspase-4/5/11激活[1]。

1.2 细胞焦亡的机制先天免疫系统的重要组成部分炎症小体,是识别致病原和无菌性损伤的宿主防御的第一道重要防线。炎症小体检测细胞质中的病原体和损伤,并响应触发细胞焦亡,这是焦亡形成的关键环节。炎症小体由五种特征明确的传感器启动,包括核苷酸寡聚结构域样受体(nucleotide binding oligomerization domain like receptors,NLR)家族中NLRP1、NLRP3、NLRP4以及IPAF、AIM2炎症小体,它们能够识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)或损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs),其传感器与细胞质中的衔接分子凋亡相关斑点样蛋白ASC(apoptosis associated speck- like protein containing a CARD domain,ASC)相互作用,招募和激活caspase-1。caspase-1加工和激活IL-1β和IL-18,切割 GSDMD形成N端结构域,一旦通过切割分离,GSDMD-N通过与磷脂酰肌醇磷酸和磷脂酰丝氨酸结合而转移到膜上,并通过形成多亚基孔寡聚化形成10～20 nm孔径通道。孔道的形成造成渗透压变化,进而破坏细胞膜,促进炎性因子IL-1β和IL-18的释放和细胞焦亡,这就是经典细胞焦亡通路。在特意阻断caspase-1通路后,并不能完全阻断细胞焦亡的发生,这涉及到细胞焦亡非经典通路。非经典通路是不依赖caspase-1激活,直接由caspase-4/5/11炎性体结合细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),从而激活GSDMD后形成孔径通路,引起细胞焦亡。

1.3 细胞焦亡相关疾病细胞焦亡参与多种疾病的发生并发挥重要作用,如感染性疾病、自身免疫疾病、心血管疾病、神经系统疾病、代谢性疾病、肺纤维化、肿瘤、肝脏疾病及妇科疾病等。最初在巨噬细胞中发现细胞焦亡,其与感染性疾病密切相关。细胞焦亡的发生会释放巨噬细胞内的细菌,比如沙门菌感染、志贺菌、李斯特菌及嗜肺军团菌等。炎性体可以控制微生物细胞功能,如在革兰阴性和革兰阳性细菌感染期间,caspase- 1可以激活调节吞噬体,由此得知细胞自主免疫需要炎性caspase。细胞焦亡参与神经退行性疾病的调控,炎症小体NLRP3和炎症因子IL-1β的异常表达可促进神经退行性疾病的病变。细胞焦亡促进炎症因子的释放,这也是痛风、糖尿病等代谢类疾病的重要发病机制。细胞焦亡与癌症之间的关系复杂,一方面,细胞焦亡可以抑制肿瘤的发生和发展;另一方面,作为一种促炎性死亡,细胞焦亡可以形成适合肿瘤细胞生长的微环境,从而促进肿瘤生长。女性常受妇科疾病的困扰,炎症小体也可以诱导妇科疾病中细胞的焦亡,比如在人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染中,炎症小体可以抑制宫颈癌的发生发展。细胞焦亡在肝脏疾病发展过程中的关键作用已被证实,比如炎性因子在非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)的过度表达,使损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)持续存在,反而增强了机体的先天免疫能力。

心血管疾病(cardiovascular diseases,CVD)是当前我国高发病率疾病,也是世界范围内引起死亡的主要原因。心血管疾病主要包括了动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)、肺动脉高压(pulmonary hypertension,PH)、冠心病、高血压和糖尿病心肌病。当焦亡发生时,会造成心血管超微结构的变化和心血管组织损伤,诱导疾病快速发展和造成心血管疾病的不良预后。如现在研究较多的动脉粥样硬化,其特征是主动脉中的异常脂质沉积、阻塞血流和随后的斑块破裂。细胞焦亡通过促进炎症因子的释放参与AS的形成和发展,与斑块稳定性密切相关的caspase-1在AS斑块中高度表达,研究发现,AS斑块和破裂病灶中的caspase-1含量显着增加。caspase-1炎性体通路可以感知升高的脂质,之后上调如NLRP3、IL-1β这类细胞焦亡相关炎症小体,最终引发细胞焦亡。

2 肺动脉高压与动脉性肺动脉高压

2.1 肺动脉高压PH是一种高发病率、高死亡率、预后差的以肺动脉异常高压为特征的心血管疾病。PH最常见的原因是左心疾病,导致了左心房高压和肺静脉压力长期升高。左心疾病导致肺静脉压力升高的常见原因有左室收缩或舒张期功能障碍以及二尖瓣或主动脉瓣疾病[2]。肺静脉高压长期存在可使肺血管阻力(pulmonary vascular resistance,PVR)升高。全球大约有1%的成年人患有PH,在65岁人群中可能达到10%。PH的定义为静息状态下的平均肺动脉压(mean pulmonary arterial pressure,mPA)≥25 mmHg,而这不作为诊断,仅为血流动力学的异常状态[3]。最近,第六届世界肺动脉高压研讨会重新定义为静息状态下的mPAP>20 mmHg,同时PVR≥3 Wood[4]。不同形式的PH主要症状都伴有疲劳、疲惫感的进行性运动性呼吸困难,以多因素肺血管床结构和功能改变为特征,进而导致肺小动脉的强烈重构,严重时致右心衰竭和死亡[3]。肺动脉高压的初期临床症状较轻且不具有典型性,容易导致诊断不及时,从而错过最佳治疗时间段。

肺动脉高压一词涵盖了除了肺循环中的血压升高之外几乎没有其他共同点的各种疾病,所以对肺动脉高压进行准确的诊断分类至关重要。世界卫生组织(World Health Organisation,WHO)将PH根据病因、病理生理和治疗分为五类:动脉性肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)、左心疾病所致肺动脉高压(PH due to left heart disease)、肺部疾病或缺氧引起的肺动脉高压(PH due to lung diseases and/or hypoxia)、慢性血栓栓塞性肺动脉高压(chronic thromboembolic PH)及不明或多因素引起的肺动脉高压(PH with unclear multifactorial mechanisms)[4]。PH临床五类及5类下亚组分类见Tab 1[4]。

2.2 动脉性肺动脉高压PAH是PH的亚型,要满足PAH有一个独特的血流动力学定义,mPAP≥25 mmHg,肺毛细血管楔压(pulmonary capillary wedge pressure,PCWP)≤15 mmHg,也有人提出新的定义mPAP的下限为20 mmHg。流行病调查PAH患病率为每100万人口中约有25人患有PAH,其中大多数为妇女。目前,在PAH临床试验和登记处有新诊断的患者的平均年龄约为53岁,这不同于早期年轻育龄妇女主要为特发性PAH典型患者的描述[5]。PAH根据潜在的病因进一步分为亚组,包括特发性PAH、遗传性PAH、药物和毒素相关的PAH、肺静脉闭塞性疾病、钙通道阻滞剂长期反应者的PAH和新生儿持续的PH,以及与其他疾病相关的PAH,例如结缔组织病、艾滋病和先天性心脏病[6]。

PAH可以理解为一种罕见的进行性疾病,其组织学典型表现为内皮功能障碍、肺动脉平滑肌细胞和成纤维细胞不受控制的增殖导致肺小动脉闭塞。肺小动脉闭塞后导致肺小动脉压力增加,进而导致右心室衰竭和死亡。肺部毛细血管是由大约2 800亿条迭代动脉分支构成,因此肺血管结构的细微致病性变化可使PVR升高。PAH病理学的基础是肺动脉平滑肌细胞、内膜成纤维细胞以及肺动脉周围细胞代谢、生存和生长模式的改变,其病理特征是丛生性动脉病变。随着疾病的发展,毛细血管前和毛细血管后的主动重塑可能加重PAH[5]。

PAH的重要特征除了PVR升高,还包括肺血管重塑的重要结构改变,表现为内侧肥大或增生、内膜和外膜纤维化、免疫细胞(B淋巴细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、树突状细胞和巨噬细胞)在血管周围浸润、积累等[7]。PAH的发病机制与许多分子过程有关,主要包括细胞焦亡、种系突变、炎症、肺动脉内皮细胞功能障碍、表观遗传修饰、DNA损伤、代谢功能障碍、性激素失衡和氧化应激等。

3 动脉性肺动脉高压的焦亡发病机制

3.1 细胞焦亡与PAH关系细胞焦亡是伴有炎症发生的细胞程序性死亡,即细胞焦亡和炎症反应关系密切。炎症是由身体损伤、感染或局部免疫反应引发的液体、血浆蛋白和白细胞的局部积聚的总称。近十年来,随着对PAH的炎症发病机制研究深入,发现PAH肺阻力血管壁内以及丛状病变周围有各种炎症因子的积累[8]。血管周围的炎症因子浸润充分说明炎症与PAH发病机制相关。

肺部循环细胞因子水平升高和血管周围炎症浸润是PAH患者表现出的症状,PAH中炎症驱动了血管重塑,其肺血管病变存在于极度发炎的微环境里。PAH患者肺部的组织病理学结果证明炎症的确可以作为PAH的病理驱动因素,炎性细胞聚集在血管壁周围,同时升高外周血炎性细胞数量。研究还发现PAH患者的细胞免疫[T淋巴细胞、自然杀伤细胞 (natural killer cell,NK cell) 和巨噬细胞)]受损。例如,NK细胞被确定为不同生理和病理条件下血管重塑的重要调节剂,从PAH患者中分离出的 NK 细胞表现出受损的表型,对转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)具有高反应性,并且伴随着疾病相关杀伤性免疫球蛋白样受体和基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein,MMP-9)的产生减少。对大量关于PAH的研究进行回顾和分析发现,PAH患者的细胞因子IL-1β、IL-6 和 IL-8水平升高,而且炎症物质的循环浓度增加进而通过经典和非经典信号转导途径引起免疫反应。这些研究结果与先天免疫反应相关,而细胞焦亡和先天免疫反应密不可分。

炎症caspase的激活是细胞焦亡发作时的一个重要初始事件,caspase-1/4/5/8/11介导的细胞焦亡在PAH的发病机制中起到了关键作用[9]。NLRP3是参与诱导PAH内皮细胞焦亡中最有特征性的炎症小体,NLRP3通过产生促炎细胞因子,介导肺动脉内皮细胞焦亡,导致肺动脉高压[10]。

3.2 PAH中细胞焦亡发病机制

3.2.1caspase-1经典途径的细胞焦亡途径是PAMPs和DAMPs接受细胞内信号分子刺激,ASC招募Pro-caspase-1,在炎症小体组装后,将Pro-caspase-1切割并活化caspase-1,裂解Gasdermin-D形成孔结构域,而后促炎因子释放。炎性环境促进PAH血管重塑,加速疾病的发展。实验研究结果表明,抑制caspase-1介导的典型炎症小体可以减轻PAH。将体质量180～200 g的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分6组,通过免疫组化染色、免疫荧光、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹的实验方法检测了caspase-1的蛋白表达水平。免疫荧光的结果和免疫组化结果表明抑制了PAH大鼠肺组织中capsase-1、NLRP3表达,蛋白质印迹结果显示,抑制了PAH大鼠的HPAEC中NLRP3、caspase-1、ASC、IL‐18、IL-1β的蛋白表达水平,抑制效果与MCC950和MDL28170相似[11]。

Tab 1 The updated clinical classification of PH into five categories and subgroups under five categories

Circ-Calm4是特定环状RNA(circRNA),其参加调节肺动脉平滑肌细胞(PASMC)焦亡相关的信号通路和靶点,进而导致PASMC焦亡和PAH发生。通过免疫印迹、实时定量PCR(quantitative real-time PCR)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放测定、荧光染色和免疫染色等实验结果,证明抑制Circ-Calm4,PASMC中细胞焦亡相关蛋白NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18会显著下调[12]。

3.2.2caspase-4/5/11 非经典途径的细胞焦亡途径是caspase-4/5/11直接与LPS结合,裂解Gasdermin-D形成孔结构域,而后促炎因子释放。caspase-4/5/11可以介导PAH内皮功能障碍增强血管炎症,进一步诱发血管重塑和右心室衰竭,从而促进PAH发病。内皮功能障碍可因炎症介质如肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)发生,其在PAH患者和动物模型中升高,研究使用TNF-α作为刺激因子。将200-250 g雄性SD大鼠分3组,通过免疫组化染色、免疫荧光、免疫共沉淀、蛋白质印迹的实验方法首次证明了抑制caspase-4/5/11有助于减轻PAH的发展。研究结果也进一步揭示了caspase-4/5/11 诱导的细胞焦亡涉及caspase-3-GSDME轴,并且caspase-4/5/11可以直接与caspase-3结合,表明TNF-α诱导的细胞焦亡可由caspase-3介导的GSDME裂解而转变为细胞焦亡。因此,通过抑制caspase-3的表达也可以达到抑制PAH发展的目的[13]。

caspase-8可以通过非经典和经典途径参与了Pro-IL-1β的合成和加工,可以调节NLRP3炎症体和裂解的caspase-1调节IL-1β的产生和释放。实验采用caspase-8基因敲除雄性SD大鼠和雄性小鼠随机分组,通过组织学分析、免疫荧光染色、免疫蛋白印迹、流式细胞术等实验,结果显示caspase-8通过巨噬细胞中的NLRP3和caspase-1途径影响IL-1β的分泌,从而促进肺动脉平滑肌细胞的增殖和炎症细胞浸润以驱动PAH的发展,抑制caspase-8的功能可对 PAH产生保护作用[10]。

非经典途径细胞焦亡也可通过加剧骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)二型首体(bone morphogenetic protein,Bmpr2)信号传导缺陷,进而加速PAH的发展。在这项研究中,使用了北京协和医院于2006年11月至2016年3月 PAH患者和非PAH患者来源的样本,并建立可靠的小鼠模型。研究结果显示,酶联免疫吸附试验检测PAH患者血清中针对BMP受体的LPS和自身抗体水平显著高于对照组,质谱流式细胞技术(Mass cytometry)比较激素治疗前后,PAH患者外周血中炎性细胞的存在变化。此外,还检测到人肺动脉内皮细胞(human pulmonary artery endothelial cells,HPAECs)中检测了响应 LPS刺激的Bmpr2信号传导和焦亡相关因子[14]。

4 药物治疗

4.1 炎症小体靶向抑制剂NLRP家族和Pro-caspase-1和ASC结合是细胞焦亡的关键事件,已确定K+流出、Ca2+信号传导、Na+流入和氯化物流出,是NLRP3炎症小体激活的关键因素。格列本脲(Glibenclamide,Gli)是一种磺脲类药物,抑制LPS+ATP诱导的caspase-1激活、IL-1β分泌以及间接抑制NLRP3。Gil抑制细胞焦亡的机制是抑制ATP的K+通道,抑制ASC聚集,从而有效地阻断caspase-1和IL-1β分泌的激活[15]。16673-34-0是Gli合成过程中产生的中间底物,Marchetti等[16]在小鼠巨噬细胞和原代成年大鼠心肌细胞中研究显示,16673-34-0抑制 NLRP3炎症小体的形成,炎症小体的药理抑制限制了小鼠左心室收缩功能障碍。遗憾的是,16673-34-0抑制细胞焦亡机制并不完全清楚。用JC124治疗后NLRP3、ASC、caspase-1、pro-IL-1β及TNF-α的蛋白表达水平显著下降,表明JC124可作为新型的细胞焦亡抑制剂[17],但对于其机制研究少且不明确。FC11A-2通过靶向NLRP3炎症小体,能显著抑制促炎细胞因子(包括TNF-α、IL-1β、IL-18、IL-17A和IFN-γ)和mRNA水平,其机制主要为抑制pro-caspase-1,pro-IL-1β and pro-IL-18的裂解,从而抑制了NLRP3炎症小体活性[18]。小白菊内酯(Parthenolide,Par)是一种运用广泛的抗炎中草药,其能显著减少促炎细胞因子的释放,包括IL-6、IL-1β、IL-1α、IL-18并且参与调节NLRP3 轴激活,虽具体机制不明朗但可能是通半胱氨酸修饰来抑制NLRP1、NLRC4 和 NLRP3的激活[19]。β-羟基丁酸酯(β-hydroxybutyrate,BHB)抑制NLRP3炎症小体介导的炎性疾病是通过阻止K+流出和减少ASC寡聚化和斑点的形成,不抑制caspase-1/11激活响应的NLR家族[20]。MCC950是一种含有二芳基磺酰脲的化合物,被认为是NLRP3炎症小体最有效的抑制剂之一,其能阻断ATP 水解并抑制 NLRP3 活化,从而抑制NLRP3炎症小体激活,但其分子靶点还没有确定[21]。3,4-亚甲二氧基-β-硝基苯乙烯(MNS)特异性地阻止了NLRP3介导的ASC斑点的形成和齐聚,MNS的细胞内靶标是NLRP3的核苷酸结合寡聚结构域和富含亮氨酸的重复结构域,体外给药也抑制了ATP酶活性[22]。CY-09直接与NLRP3中NACHT结构域的ATP结合并抑制NLRP3 ATPase活性,从而抑制NLRP3炎症小体激活[23]。曲尼司特(Tranilast,Tra)直接与NLRP3的 NACHT结构域结合,并通过阻断NLRP3寡聚化来抑制 NLRP3炎症小体的活性[24]。冬凌草素(Oridonin,Ori)在NACHT结构域中,与NLRP3的279位半胱氨酸形成共价键,阻断NLRP3与NEK7的之间的相互作用,从而抑制NLRP3炎症小体的激活[25]。OLT1177通过直接与NLRP3结合以阻断其ATP酶活性,并阻断NLRP3与ASC或NLRP3与caspase-1之间的相互作用来抑制NLRP3炎症小体的激活[26]。

细胞因子反应调节剂A(CrmA)是第一个发现的caspase抑制剂,CrmA可以作为假底物结合caspase-1并阻断caspase-1切割pro-IL-1β,从而减少IL-1β的分泌,其可有效抑制caspase-1/3/4/5/8表达[27]。Benzoxycarbonyl-Val-Ala-Asp (OME) -fluoromethylketone(z-VADfmk)是通过不可逆地烷基化半胱氨酸残基来抑制casapase的活性,从而抑制细胞焦亡,这属于caspase的广谱抑制剂。VX740和VX765是caspase-1的选择性拟肽抑制剂,均可通过共价修饰caspase-1活性位点处的半胱氨酸残来抑制IL-1β和IL-18的裂解[28]。Ac-FLTD-CMK是GSDMD衍生的抑制剂,可通过体外抑制caspases-1/4/5/11活性,从而抑制对GSDMD的切割,减少炎症因子的释放[29]。

4.2 肺血管扩张剂目前针对PAH的肺血管扩张剂治疗有3种途径:刺激一氧化氮(nitric oxide,NO)-环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)生物途径、增加前列环素(prostaglandin I2,PGI2)对受体的作用和拮抗内皮素(Endothelin,ET)途径,而采用多种治疗途径的肺血管扩张剂联合药物治疗在生存结局和临床恶化时间方面优于单一治疗方案[6,30]。NO通过激活可溶性鸟苷酸环化酶(guanylate cyclase,cGMPase)发挥肺血管扩张剂的作用,刺激cGMP的产生,进而激活肌球蛋白轻链磷酸酶,降低肌球蛋白的磷酸化,而后降低肺血管张力。增加细胞内的cGMP也可抑制钙的进入,减少细胞内钙从而减少肥大和增生,以及可能逆转肺动脉重塑。PGI2来源于血管内皮细胞和平滑肌中,它会引起血管舒张,并抑制平滑肌细胞增殖和血小板聚集,是一种有效的肺动脉血管扩张剂。合成的前列环素包括依前列醇(prostaglandin I2,PGI2)、曲前列素(treprostinil,Tre)、伊洛前列素(iloprost,Ilo)和选择性前列环素受体(IP受体)激动剂如司来帕格(selexipag,Sel)。ET-1主要由血管内皮细胞分泌,是一种有效的内源性血管收缩剂。ET受体拮抗剂,如波生坦(bosentan,Bos)、安立生坦(ambrisentan,Amb)和马西替坦(macitentan,Mac),可阻断ET-1的活性,促进PAH 患者的肺血管扩张。

Fig 1 Pulmonary artery hypertension injury mediated by pyroptosis and related therapeutic drugs

5 结语与展望

总之,细胞焦亡中炎性体传感器识别多种病原体和损伤相关分子模式的能力表明,焦亡对机体防御病原体至关重要。焦亡使细胞释放细胞质内容物,从而提供启动炎症级联反应的有效信号,局部炎症导致免疫细胞的募集和启动,最终有助于从机体清除病原体。研究细胞焦亡与PAH之间的关系可以发现新的信号成分和通路机制,这或许可以进一步预防或治疗PAH。遗憾的是,动物实验虽证明了多个靶点药物对PAH的抑制作用但很多作用机制不明或其分子靶点不确定。许多问题仍待解决,例如16673-34-0、小白菊内酯抑制NLRP3的具体机制,确认MCC950分子靶点。相信随着研究靶点抑制剂机制的不断深入,探索药物靶点的开发,可以为PAH患者提供安全有效的治疗方案,提高临床疗效和安全性。