不饱和脂质氮杂环丙烷化反应中间体的原位质谱分析

陈凯祥,魏是奇,陈素明

(武汉大学高等研究院,湖北 武汉 430072)

脂类物质是一类重要的生物分子,在生物系统中发挥着关键作用[1-2],它们不仅是生物膜的重要组成成分,还在能量储存、信号转导等生物过程中扮演着重要角色[3-4]。不饱和脂质是包含1个或多个碳-碳双键的脂质亚类,脂质双键的位置对其结构和功能有着重要影响,精确解析脂质双键异构体是深入理解不饱和脂质生物学功能的前提[5]。质谱(mass spectrometry, MS)是分析脂质结构的有力工具[6-7]。有研究表明,烯烃的臭氧分解反应[8]、Paterno-Büchi反应[9]、环氧化反应[10]、交叉复分解反应[11]等均可用于脂质双键的活化和衍生,结合串联质谱可进行双键位置异构体的分析。其中,烯烃的氮杂环丙烷化反应是最新发现的一种脂质双键衍生方法[12-14]。

本工作拟利用θ型毛细管代替常规纳升静电喷雾离子化质谱(nESTASI-MS)装置中的普通玻璃毛细管[19-20],使θ毛细管两侧的溶液在电喷雾时进行在线混合和反应,然后进入质谱分析,以便捕获反应过程中的短寿命中间体。同时,以N-Me-DPH为胺化试剂,磷脂酰胆碱(PC 18∶1/18∶1)为代表性底物,研究N-Me氮杂环丙烷化反应的中间过程,希望为阐明氮杂环丙烷化反应机理提供数据支持。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

Orbitrap Elite LTQ XL高分辨质谱仪:德国Thermo Fisher Scientific公司产品,配有Xcalibur 4.1数据处理系统;DDS数字合成函数信号发生器:中国国睿安泰信公司产品;10HVA24高压放大器:美国Advanced Energy公司产品;24 V直流电源:广东粤海电子公司产品;P-97拉针仪:美国Sutter公司产品。

1.2 主要材料与试剂

磷脂酰胆碱PC 36∶2(18∶1 (Δ9)/18∶1 (Δ9))、PC 34∶1 (16∶0/18∶1 (Δ9)):美国Avanti Polar Lipids公司产品;三氟乙醇(TFE):纯度为99.9%,北京伊诺凯科技有限公司产品;N-Me-DPH、Rh2(esp)2:上海毕得医药科技有限公司产品;θ毛细管:美国Harvard Apparatus公司产品。

1.3 实验方法

使用拉针仪拉制毛细管,制备适用于nESTASI-MS的θ毛细管(1.5 mm×0.13 mm×0.17 mm),使其一端呈尖锐形状,作为反应底物的容器和nESTASI-MS的发射器。拉针仪参数条件为:HEAT=523,PULL=15,VEL=14,TIME=150。实验时,将θ毛细管固定在适配台上,使其尖端正对质谱仪的离子进样口,距离约8 mm;毛细管尖端的下方放置1个垂直向上的圆形盘铂电极(外层为聚四氟乙烯材料,内部铂电极直径为2 mm),毛细管与电极的距离约5 mm;电极与脉冲高压装置(方波,频率385 Hz,电压8 kV)相连,从而在毛细管下方产生脉冲高压电场。检测样品时,在θ毛细管两侧通道各装入10 μL对应底物溶液,打开脉冲高压电源,毛细管尖端会形成静电喷雾使分析物离子化后进入质谱分析,喷雾持续时间在2 min以上。

1.4 质谱条件

正离子模式,质量扫描范围m/z100～2 000,最大离子注入时间100 ms,分辨率60 000。

2 结果与讨论

2.1 基于θ毛细管的纳升静电喷雾离子化质谱分析装置的构建

基于θ毛细管的nESTASI-MS分析装置示意图示于图1。当打开高压电源时,在θ毛细管和质谱仪进样口之间形成强大的脉冲电场,导致静电电荷在毛细管尖端裸露的溶液表面累积。有研究[21]表明,当溶液表面的电荷累积过多时,表面张力将不足以阻止带电液滴形成喷雾,此时会突然形成静电喷雾使溶液中的待测分子离子化而被质谱检测。θ毛细管两侧的溶液会同时受到静电场的作用而喷射出来,并在管口处混合。因此,如果两侧装有不同的反应试剂,可以监测溶液在线混合后的反应过程。

图1 基于θ毛细管的纳升静电喷雾离子化质谱装置示意图Fig.1 Schematic of nano-electrostatic spray ionization-mass spectrometry device based on θ capillary

在θ毛细管两侧分别装入TFE和1 mmol/L PC 36∶2溶液,打开电源后,可以稳定地观测到PC 36∶2的质谱图,其中m/z786.603 0、808.582 3分别是PC 36∶2的质子化离子和钠离子加合离子,初步验证了该装置的可行性,示于图2a。然后,测试该装置对2种溶液的检测能力,当在θ毛细管两侧分别装入1 mmol/L PC 34∶1、PC 36∶2溶液时,可同时观测到2种物质的质谱峰,m/z782.567 9、808.581 5分别是PC 34∶1、PC 36∶2的钠离子加合峰,示于图2b。该θ毛细管2个通道中的分析物可在喷雾离子化过程中混合,然后进入质谱检测,大大缩短了2种反应物混合后的停留时间,为成功捕获反应过程中短寿命中间体提供了条件。

注:a.θ毛细管两侧分别装入三氟乙醇和PC 36∶2溶液;b.θ毛细管两侧分别装入PC 34∶1和PC 36∶2溶液图2 基于θ毛细管的nESTASI-MS装置验证Fig.2 Validation of the θ capillary-based nESTASI MS setup

2.2 不饱和脂质的直接N-Me氮杂环丙烷化反应过程中间体研究

以PC 36∶2和N-Me-DPH为反应物,Rh2(esp)2为催化剂,研究不同混合模式下的N-Me氮杂环丙烷化反应过程。根据文献[17]推测的氮杂环丙烷化反应机理,PC 36∶2的N-Me氮杂环丙烷化反应可能的中间过程示于图3。首先,N-Me-DPH与催化剂Rh2(esp)2反应生成铑-氮烯中间体1,同时失去1分子二硝基苯酚;然后,中间体1与PC 36∶2的双键作用,形成含有第1个C-N键的三元双自由基中间体2;最后,形成第2个C-N键,Rh-N键断裂,生成含1-甲基氮丙啶结构的产物。其中,中间体1和中间体2是该反应可能的中间体,但尚缺乏直接证据。

图3 Rh2(esp)2催化下PC 36∶2与N-Me-DPH的氮杂环丙烷化反应可能的中间过程Fig.3 Possible intermediate process in the Rh2(esp)2-catalyzed aziridination reaction of PC 36∶2 with N-Me-DPH

用θ毛细管nESTASI-MS装置研究反应过程。在第1种混合模式下,以TFE为溶剂,将催化剂Rh2(esp)2与N-Me-DPH溶液预混合,使二者浓度分别为0.1、1 mmol/L,装入θ毛细管的一侧,将1 mmol/L PC 36∶2溶液装入另一侧,然后进行nESTASI-MS分析,结果示于图4。在质谱图中仅观察到PC 36∶2的质子化峰(m/z786.600 7)和钠离子加合峰(m/z808.582 6),未检测到相关中间体和产物质谱峰。

图4 第1种混合模式下的θ毛细管nESTASI 质谱图Fig.4 θ Capillary-based nESTASI mass spectrum in the first mixing mode

在第2种混合模式下,将PC 36∶2与催化剂Rh2(esp)2溶液预混合,使二者浓度分别为1、0.1 mmol/L,装入θ毛细管的一侧,将1 mmol/LN-Me-DPH溶液装入另一侧,然后进行nESTASI-MS分析,结果示于图5。可见,检测到铑-氮烯中间体1的加氢峰(m/z788.117 9)和加钠峰(m/z810.589 6),氮杂环丙烷化产物的加氢峰(m/z815.627 7),以及三元双自由基中间体2的质子化离子峰(m/z1 573.719 0)。通过对中间体1进行串联质谱分析,进一步确证其结构,示于图5c。虽然PC 36∶2含有2个双键,但仅单个双键发生反应的产物是主要产物,且任一双键发生反应的产物质量数均相同。此外,还检测到2个双键同时发生反应的产物,其质子化离子峰为m/z844.652 2,示于图5d。虽然其强度仅为单个双键反应产物的10%,但可为多个双键位置的同时鉴定提供可能。

注:a.低质量区;b.高质量区;c.中间体1的二级质谱图;d.PC 36∶2单个双键反应产物和2个双键反应产物质谱图图5 第2种混合模式下的θ毛细管nESTASI 质谱图Fig.5 θ Capillary-based nESTASI mass spectra in the second mixing mode

在第3种混合模式下,将PC 36∶2与N-Me-DPH预混合,使其浓度均为1 mmol/L,装入θ毛细管的一侧,将0.1 mmol/L催化剂Rh2(esp)2装入另一侧,然后进行nESTASI-MS分析,结果示于图6。可见,检测到中间体1的加氢峰(m/z788.118 6)和加钠峰(m/z810.590 5),以及产物的加氢峰(m/z815.628 8),表明在这种混合模式下可以发生反应,但产物的量较少。

注:a.低质量区;b.高质量区图6 第3种混合模式下的θ毛细管nESTASI 质谱图Fig.6 θ Capillary-based nESTASI mass spectra in the third mixing mode

仅在第1种混合模式下未观察到中间体和产物,推测N-Me-DPH与Rh2(esp)2混合可能会使催化剂失活,继而影响N-Me-DPH与PC 36∶2的进一步反应。同时,也体现了本工作开发的具有在线混合反应功能的θ毛细管nESTASI-MS装置的优势。

2.3 N-Me氮杂环丙烷化反应用于脂质双键位置的鉴定

N-Me氮杂环丙烷化衍生可以在双键处生成1-甲基氮丙啶结构,该结构在质谱碰撞诱导解离(CID)过程中容易发生断裂,生成指示双键位置信息的碎片离子。本研究以PC 36∶2为例,考察其氮杂环丙烷化产物的质子化离子在CID模式下的解离行为。衍生产物离子的CID-MS/MS谱图示于图7a,出现了2个较高的质谱峰m/z756.555 1和632.562 5,分别是产物离子失去磷酸胆碱头基末端的N(CH)3和整个磷酸胆碱头基得到的。同时,在1-甲基氮丙啶结构处断裂得到的碎片离子m/z506.421 6丰度较低。以上结果表明,相较于衍生的氮丙啶结构,PC的磷酸胆碱头基在CID过程中更易丢失。为得到相对丰度更高的双键诊断离子,进一步对丢失头基的碎片离子m/z632.562 5进行CID,得到PC 36∶2衍生产物的三级质谱图,示于图7b。在此条件下,氮丙啶结构发生了明显碎裂,分别得到靠近酰基端和甲基端的C-N键断裂生成的碎片离子m/z477.394 3和506.420 8。通过碎片离子质量可以判断双键的位置在Δ9位。由于PC 36∶2另1条脂肪链上的双键位置也在Δ9位,因此无论是哪1个双键被衍生,得到的产物碎片离子均相同。从衍生产物离子的二级和三级质谱图上没有观察到指示其他双键位置信息的离子,表明PC 36∶2中没有双键在其他位置的脂肪链。因此,推测PC 36∶2的精确结构是PC 18∶1 (Δ9)/18∶1 (Δ9)。

注:a.CID-MS/MS谱图;b.CID-MS3谱图;c.可能的碎裂途径图7 PC 36∶2氮杂环丙烷化衍生产物用于CC键位置的鉴定Fig.7 Location identification of CC bond by aziridination product of PC 36∶2

甲基取代的氮丙啶结构具有较高的质子亲和势(934.8 kJ/mol)[22],因此,不饱和脂质进行氮杂环丙烷化标记后,在电喷雾质谱分析中具有较高的灵敏度,可以提高复杂体系中脂质双键异构体的鉴定效率。本课题组[12]研究表明,N-Me氮杂环丙烷反应结合液相色谱-质谱联用法可实现人血清中大量脂质异构体的鉴定。将本研究的基于纳升静电喷雾离子化的直接进样方法,与N-Me氮杂环丙烷化衍生反应相结合,可用于复杂生物样本中脂质双键异构体的鉴定。

3 结论

本工作使用基于θ毛细管的纳升静电喷雾离子化质谱分析装置,实现了不同反应物的在线混合和质谱监测,通过研究不同混合模式下的氮杂环丙烷化反应过程,直接观测到了N-Me氮杂环丙烷化反应过程中的铑-氮烯中间体和三元双自由基中间体,为该反应机理的确证提供了关键信息,该装置也为反应过程中短寿命中间体的捕获和鉴定提供了有效方法。