从细胞焦亡角度挖掘治疗湿热蕴结型盆腔炎性疾病后遗症的天然药物成分Δ

龙 茜,林 洁

(1.湖南中医药大学中医学院,长沙 410208; 2.湖南中医药大学第一附属医院妇产科,长沙 410007)

盆腔炎性疾病后遗症(sequelae of pelvic inflammatory disease,SPID)是育龄期妇女常见的多发性上生殖道感染性疾病,主要包括子宫内膜炎、输卵管炎和盆腔组织炎等。在临床上常表现为慢性盆腔痛等反复发作,甚至造成不孕。现代研究结果表明,SPID多为病原体感染所致[1]。针对盆腔感染,西医治疗首选抗菌药物,具有起效快的特点,但极易产生耐药性,若治疗不彻底则会引起病情反复,进而促进疾病发展,影响患者的生活质量[2]。SPID具有反复发作的特点,生殖系统周围组织易因炎症物质渗出而产生局部的纤维性粘连、增生、瘢痕以及损伤等诸多后遗症[3]。目前,西医治疗SPID的方法较为单一。中医药治疗SPID具有优势,讲究辨证论治,因人施治,对不同个体采取不同的治疗方案,并且强调整体观念,基于“人为一个整体”“天人合一”等观念而进行辨证施治,在临床上运用广泛[4-7]。通过临床辨证论治总结与文献查阅[8],笔者发现SPID以湿热蕴结型最常见。

细胞焦亡是程序性细胞的死亡方式,其可促进炎症反应形成,主要表现为可引起细胞肿胀、破裂,同时使细胞内的炎症物质得到释放,进而引起炎症反应[9]。研究发现,细胞焦亡在许多炎症性疾病的发生、发展中发挥着重要作用[10-11]。适度的炎症反应是生理应对异己的正常反应,但过度的炎症损害则会对机体组织造成伤害。有学者认为,细胞焦亡与中医理论中的“痰、瘀、毒”相似,而SPID多为湿热毒邪所引起,蕴久便成瘀,或与细胞焦亡有密切联系[12]。本研究通过生物信息学及分子对接技术分析细胞焦亡与湿热蕴结型SPID之间的关联,并进一步挖掘其相关的天然药物成分,以期为SPID的治疗与研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 筛选SPID数据集及靶点差异分析

通过GEO数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)检索与SPID相关的数据集,并根据以下标准进行筛选：(1)样本量>15;(2)同时包含正常样本以及疾病样本。将筛选通过规范处理后的数据集矩阵导入Sanger平台(http：//vip.sangerbox.com/home.html),对数据集中的靶点进行limma差异分析。在分析设置中选定FDR<0.05,表达差异倍数>1.5,得到靶点差异分析火山图及热图。

1.2 湿热蕴结型SPID靶点收集

通过GeneCards(https：//www.genecards.org/)数据库对湿热蕴结型SPID进行检索,以《中药新药临床研究指导原则(试行)》中湿热蕴结型SPID的主症及次症为依据,输入“下腹胀痛”“腰骶胀痛”“带下量多”和“带下色黄味臭”等主症,“月经过多”“经期延长”“神疲乏力”“阴道不规则出血”“经期腹痛”“小便黄”“大便干燥或腹泻”“舌质红”“苔黄腻”和“脉滑数”等次症进行检索,除重后得到湿热蕴结型SPID靶点。

1.3 细胞焦亡靶点收集与分析及与湿热蕴结型SPID的共同靶点筛选

在中国知网、万方数据库和PubMed等文献数据库中,以“细胞焦亡”“Cell pyrolysis”为关键词进行检索,通过对文献的研读,排除非人类相关基因,筛选与细胞焦亡相关的靶点,归纳整理后通过Reactome数据库(https：//reactome.org)对获得的靶点进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析以获得细胞焦亡相关的发生机制。将收集得到的细胞焦亡相关靶点与湿热蕴结型SPID靶点取交集得到三者之间的共同靶点。

1.4 筛选通过细胞焦亡治疗湿热蕴结型SPID的天然药物

通过Connectivity map(CMap Build2)平台(https：//portals.broadinstitute.org/cmap/)预测药物小分子。CMap平台可通过与疾病基因表达谱的比较,得到相关小分子化合物,并给予-1～1的分数。文献报道,小分子化合物与疾病之间的分数的绝对值越接近于1,则代表该小分子化合物对疾病更可能有治疗作用[13]。通过差异分析得到的SPID靶点与收集得到的湿热蕴结型靶点、细胞焦亡靶点取交集后将共同靶点按照在SPID中上调表达、下调表达分类,分别命名为“up signature”“down signature”。以*grp的形式导入CMap Build2后得到结果,结果以P<0.05、score<0筛选,并按照score大小排序。将所有符合条件的药物小分子在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,https：//old.tcmsp-e.com/index.php)中检索获得天然药物小分子,进一步检索可获得其对应的天然药物。

1.5 共同靶点与天然药物小分子成分的分子对接验证

获得湿热蕴结型SPID与细胞焦亡的共同核心靶点所预测得到的天然药物分子后,将二者进行分子对接,根据Auto Dock软件要求,需要收集核心靶点*PDB格式以及天然分子*mol2格式,分别通过PDB数据库(https：//www.rcsb.org/)、TCMSP数据库获得。通过Auto Dock软件将化合物及靶蛋白进行对接。将对接结果导入PyMOL进行可视化处理,对接能量数据以热图呈现。一般认为,对接能量越低,配体与受体结合的构象越稳定,发生作用的可能性越大。

2 结果

2.1 GEO数据库筛选SPID数据集及靶点差异分析

通过GEO数据库检索SPID相关的数据集,筛选确定GSE165004数据集。GSE165004数据集发表于2021年1月18日,包含样本量72例,其中疾病样本48例,正常对照样本24例。将筛选出的数据集下载导出并进行数据的规范处理后进行limma差异分析,共得到差异表达靶点3 073个,见图1。

2.2 湿热蕴结型SPID靶点收集

通过GeneCards数据库以湿热蕴结型SPID的主症及次症为检索依据检索,除重后分别得到主症及次症对应靶点7 099、10 714个,经过合并除重后共得到11 203个湿热蕴结型SPID靶点。

A.火山图;B.热图。A.volcanic map; B.heat map.图1 数据集GSE165004差异表达图Fig 1 Difference representation diagram of dataset GSE165004

2.3 细胞焦亡靶点收集

通过对数据库进行文献检索,得到现有研究中细胞焦亡的相关靶点33个,见表1。对该33个基因靶点进行KEGG分析,结果显示,细胞焦亡与免疫、炎症反应等信号通路相关,见图2。

图2 细胞焦亡相关靶点KEGG富集分析Fig 2 Analysis of KEGG enrichment of cell pyroptosis-related targets

2.4 细胞焦亡与湿热蕴结型SPID的共同靶点筛选

将收集获得的细胞焦亡靶点、SPID靶点及其湿热蕴结型靶点进行汇总后取交集,最终获得4个湿热蕴结型SPID与细胞焦亡相关的靶点,分别为白细胞介素(IL)18、半胱氨酸蛋白酶(CASP)9、CASP5和NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白(NLRP)3。其中,IL-18、CASP5和NLRP3为上调基因,CASP9为下调基因。

2.5 CMap数据库筛选通过细胞焦亡治疗湿热蕴结型SPID的天然药物

通过CMap数据库进行反向预测,以P<0.05且score<0为依据,共获得了48种药物成分,通过TCMSP筛选获得8种天然药物成分,并进一步检索以获得该天然药物的来源。通过计算分析得到,喜树碱为最有可能治疗SPID的天然小分子药物,其来源于黑芝麻;芹菜素、小檗碱和金合欢素来源于多种天然药物包括清热利湿药如黄柏、败酱草和虎杖等;金合欢素与芹菜素共同来源于天然药物败酱草,见表2。

2.6 共同靶点与天然药物小分子成分的分子对接验证

通过Auto dock将共同靶点与天然药物小分子进行对接,其中天然成分小分子哈尔满、玫瑰树碱因出现错误对接失败。分子对接结果显示,共同靶点与天然药物小分子的结合能均<0,提示两者可自发地结合。分析分子对接结果可见,靶点CASP5与配体分子小檗碱的结合能最低,为-5.45 kJ/mol,表明该配体与受体的构象最为稳定。具体对接结果见图3。选取每种天然小分子与其对应靶点结合能量最低的结果进行可视化,见图4。

图3 预测靶点与各成分的结合能量热图(kJ/mol)Fig 3 Energy heat map of binding of the predictive target and each component (kJ/mol)

表2 CMap数据库筛选潜在与细胞焦亡相关的湿热蕴结型SPID天然药物成分Tab 2 CMap database calculation of potential natural pharmaceutical components for cell pyroxeposis-related SPID of damp-heat accumulation type

A.小檗碱与CASP5(结合能-5.45 kJ/mol);B.金合欢素与IL-18(结合能-3.60 kJ/mol);C.葶苈苷与CASP9(结合能-3.34 kJ/mol);D.喜树碱与CASP5(结合能-4.62 kJ/mol);E.荷包牡丹碱与CASP5(结合能-4.53 kJ/mol);F.芹菜素与CASP5(结合能-3.97 kJ/mol)。A.berberine with CASP5 (binding energy -5.45 kJ/mol); B.acacetin with IL-18 (binding energy -3.60 kJ/mol); C.helveticoside with CASP9 (binding energy -3.34 kJ/mol); D.camptothecin with CASP5 (binding energy -4.62 kJ/mol); E.bicuculline with CASP5 (binding energy -4.53 kJ/mol); F.apigenin with CASP5 (binding energy -3.97 kJ/mol).图4 各成分与关键靶点的对接位点及对接能量Fig 4 Docking site and docking energy of each component and key target

3 讨论

SPID是困扰现代育龄期妇女的一类常见疾病,多由盆腔炎治疗不彻底、迁延不愈发展而来。临床以湿热蕴结型较常见。通过明确细胞焦亡与湿热蕴结型SPID共同的表达靶点并定位其具体天然药物成分,或可为SPID的治疗带来创新。

本研究通过生物信息学分析得出细胞焦亡与湿热蕴结型SPID的共同靶点为IL-18、CASP9、CASP5和NLRP3。IL-18、炎症小体NLRP3在各类慢性炎症如溃疡性结肠炎、肠息肉等[14-15]中均有表达。NLRP3可促进其下游的炎症因子IL-18的表达而使组织发生纤维化[16]。有研究表明,CASP5可通过其底物GSDMD介导细胞焦亡,而细胞焦亡可控制炎症小体依赖性细胞因子的分泌,并有助于抗菌防御和炎症小体介导的自身炎症疾病[17]。另有研究发现,随着IL-18的表达水平升高,部分细胞发生焦亡越多,死亡的细胞又可通过释放炎症信号导致更多的细胞因焦亡而死亡,进而加剧损伤性的炎症反应,导致组织发生持续感染[18]。在SPID的发生、发展中,组织纤维化是引起后遗症的关键病因,多由长久的炎症物质的释放造成,导致盆腔组织广泛粘连,进而出现如慢性盆腔痛等后遗症[19]。通过改善过度的炎症反应所引起的组织粘连,可以延缓SPID的发展,缓解患者的不适症状。

通过对关键靶点反向预测计算分析,可得到天然药物成分有小檗碱、玫瑰树碱、金合欢素、哈尔满、葶苈苷、喜树碱、荷包牡丹碱和芹菜素8种。小檗碱是具有广泛抗炎和免疫调节作用的药物,多从黄连、黄柏等清热解毒药物中提取。有研究表明,小檗碱可通过干预NLPR3而抑制过度的炎症反应发生[20]。荷包牡丹碱是γ-氨基丁酸A受体拮抗剂,有研究发现,在脊髓输注γ-氨基丁酸A受体拮抗剂可缓解关节的炎症[21]。玫瑰树碱是具有抗炎活性、抗肿瘤等功效的生物碱,现代研究发现,其对多种炎症因子有抑制作用[22-23]。哈尔满是具有广泛生物活性的β-咔啉类化合物,研究表明其或可发挥抗菌作用[24]。喜树碱是用于各种肿瘤治疗的广谱抗肿瘤药物,具有一定的生物毒性,可抑制IL-6、IL-1β的表达,减轻组织水肿[25]。金合欢素、芹菜素为天然黄酮类化合物,共同来源于天然药物败酱草,在中医理论中,败酱草具有清热解毒、活血化瘀止痛的功用。金合欢素具有抗炎、抗纤维化和抗氧化等作用,并可抑制促炎因子IL-6的释放,从而减缓机体的炎症反应[26]。现代研究表明,芹菜素也具有一定的抗炎及抗纤维化作用,可使IL-6、IL-1β和肿瘤坏死因子α等炎症相关物质的血清含量降低[27];可抑制瘢痕组织形成纤维化,并具有促进成纤维细胞凋亡的作用[28]。SPID的治疗以抑制过度炎症反应损伤组织,减少炎性渗出使局部组织发生纤维化的粘连为主。中医认为,SPID多为气血运行受阻、脏腑气机不利,加之湿热下注、蕴久便成瘀,瘀血阻滞胞宫,治则以清热利湿解毒、行气活血化瘀为主[29]。通过获得的天然药物成分,寻找分析其所来源的天然药物,发现芹菜素、小檗碱和金合欢素来源于多种天然药物,包括清热利湿药如黄柏、败酱草和虎杖等,与中医理论所探讨的湿热蕴结型SPID的治疗思路不谋而合。

本研究通过生物信息学分析得到了从细胞焦亡角度治疗湿热蕴结型SPID的相关靶点及天然药物成分。其结果与现有文献研究观点基本一致,但关于上述成分是否能明确成为治疗湿热蕴结型SPID的天然药物成分,仍需要实验探究和证明。通过生物信息学计算分析获得可靠的治疗药物,可为后续的研究指明方向,对临床挖掘治疗SPID的新药具有重要意义,同时也可丰富中医药的研究方法,为中医药的研究方向寻找新思路。