基于网络药理学与分子对接方法探讨羌活胜湿汤治疗类风湿关节炎的作用机制Δ

张慧月,刘洋洋,孙 磊,吴记勇#

(1.山东省第二人民医院药学部,济南 250022; 2.山东中医药大学药学院,济南 250355)

羌活胜湿汤出自金代医家李东垣的《内外伤辨惑论》,处方为羌活、独活、藁本、防风、甘草、川芎和蔓荆子,具有祛风、胜湿、止痛的功效,用于治疗风湿性关节炎、类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)、骨质增生症和强直性脊柱炎等属风湿在表者[1]。《类风湿关节炎病证结合诊疗指南》[2]中,对于风湿痹阻证,推荐使用羌活胜湿汤以祛风除湿,通络止痛。本研究通过网络药理学的研究方法探讨羌活胜湿汤治疗RA的物质基础与作用机制,并结合分子对接技术对其核心成分及作用靶点进行验证,以期为羌活胜湿汤的临床应用和实验研究提供新的思路和依据。

1 资料与方法

1.1 羌活胜湿汤活性成分及靶点筛选

基于中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP),检索羌活胜湿汤中羌活、独活、防风、川芎、蔓荆子、藁本和甘草7味中药的化学成分,并根据药动学特性参数筛选活性成分,设定筛选标准为口服生物利用度(OB)≥30%,类药性(DL)≥0.18,并在TCMSP数据库“Related Targets”模块获取药物的靶点蛋白。利用Uniprot数据库(https：//www.uniprot.org/)将羌活胜湿汤中活性分子的相关靶点进行标准化。

1.2 RA相关靶点筛选

以“Rheumatoid arthritis”为关键词,在GeneCards数据库(https：//www.genecards.org)中查找与RA相关的靶点基因,相关性>5;在人类孟德尔遗传综合数据库(OMIM,http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)中检索进行补充。将2个数据库搜索到的关于RA的靶点基因合并,去除重复和假阳性结果。

1.3 药物-疾病-靶点网络构建

利用R语言(https：//www.r-project.org/),获得羌活胜湿汤与RA共同靶点基因,即羌活胜湿汤治疗RA的潜在靶点,并绘制韦恩图。应用Cytoscape 3.8.2软件,构建羌活胜湿汤中各味中药的活性成分及RA靶点基因相互作用的网络图,通过Analyze Network计算度值,得到度值排序居前5位的活性成分。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建与分析

将羌活胜湿汤-RA靶点基因导入STRING数据库(https：//string-db.org/)[3],物种选择人类“Homo sapiens”,隐藏离散的节点,设置置信度评分>0.90,完成PPI网络构建,生成PPI网络图,导出分析数据文件,利用R语言计算各节点的度值,对度值排序居前30位的靶点基因作柱形图进行可视化。

1.5 基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

利用R语言和Bioconductor生物信息软件包(http：//www.bioconductor.org),对获得的基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析包括细胞成分(CC)、分子功能(MF)和生物过程(BP)3个部分,设定P≤0.05,取P值前20条作图,以条形图和气泡图的形式进行呈现。运用Cytoscape 3.8.2软件构建KEGG信号通路-靶点网络图。

1.6 分子对接

为验证所筛选的羌活胜湿汤治疗RA可能关键靶点基因的准确性,以“1.4”项下得出的度值排序居前5位的靶点基因作为受体蛋白,通过RCSB PDB数据库(http：//www1.rcsb.org/)查找靶点蛋白的3D结构并下载为pdb格式。运用Pymol软件进行蛋白与配体的拆分、去水等操作,中药活性成分通过Pubchem数据库(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[4]获得3D结构,使用ChemBio3D Ultra 14.0软件将其转换为mol2格式的文件。运用Auto Dock Tools将pdb和mol2文件处理后转换成pdbqt格式文件,通过Auto Vina进行分子对接并计算结合自由能[5-6]。活性分子与靶蛋白结合能量越低时,其构象越稳定,发生作用的可能性越大。

2 结果

2.1 中药化学成分筛选及靶点收集结果

通过筛选,在TCMSP数据库得到羌活的活性成分15个,独活的活性成分9个,防风活性成分18个,川芎活性成分7个,藁本活性成分1个,蔓荆子活性成分27个,甘草活性成分92个。整理后共得到化合物142个。获得相关靶点2 705个,经过去重及Uniprot数据库标准化注释后得到2 497个靶点基因。

2.2 RA靶点筛选结果

通过GeneCards数据库检索,得到5 017个基因,筛选相关度>5并去除重复后,得到RA相关基因604个;通过OMIM数据库进行检索,整理去重得到42个相关基因,将两组数据合并去重后,共得到RA相关基因633个。

2.3 中药-活性成分-靶点网络构建结果

将羌活胜湿汤的作用靶点与RA相关基因进行映射得到交集基因70个,即羌活胜湿汤治疗RA的潜在靶点。运用Cytoscape 3.8.2软件构建中药-活性成分-靶点基因相互作用的网络图,见图1。运用Analyze Network计算得到度值排序居前5位的活性成分为槲皮素、木樨草素、山柰酚、汉黄芩素和甘草查尔酮A。

2.4 PPI网络构建与分析结果

将羌活胜湿汤-RA作用靶点基因导入STRING数据库生成PPI网络图,见图2;导出分析数据文件,利用R语言对度值排序居前30位的靶点基因作柱形图进行可视化,见图3。度值排序居前4位的靶点分别为信号转导及转录激活因子3(STAT3)、JUN原癌基因、相关因子A(RELA)、丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)1和MAPK14。

图1 中药-活性成分-靶点网络图Fig 1 Traditional Chinese medicine-active components-target network diagram

图2 PPI网络图Fig 2 PPI network

2.5 GO功能及KEGG富集结果

(1)GO富集分析得到1 592个BP,21个CC,95个MF。对富集前20条功能注释条目和信号通路进行分析,并作柱状图和气泡图,见图4—6。(2)KEGG通路富集分析得到130条通路,对富集前20条功能注释条目和信号通路进行分析,柱状图和气泡图见图7。通过对KEGG通路富集结果进行分析,剔除与RA无关的信号通路,如癌症、钩形虫、肝炎、麻疹和肺结核等,经校正取富集基因数居前20位的通路,构建羌活胜湿汤治疗RA的靶点-信号通路网络图,见图8。图8中,黄色代表通路,红色代表靶点,图形的大小表示富集的显著程度,图形越大表明富集越显著。主要富集通路有白细胞介素(IL)17信号通路、Toll样受体信号通路、Th17细胞分化、NOD样受体信号通路、破骨细胞分化、MAPK信号通路、Th1和Th2细胞分化、核因子κB(NF-κB)信号通路、T细胞受体信号通路、类风湿性关节炎、HIF-1信号通路等。

2.6 分子对接结果

羌活胜湿汤活性成分与靶点蛋白结合能见图9,结果表明,羌活胜湿汤活性成分与RA靶点结合能均<-28.5 kJ/mol,结合构象较稳定。部分结合模式图见图10。

图3 靶点柱状图Fig 3 Target histogram

3 讨论

3.1 羌活胜湿汤处方分析

RA属于中医痹症范畴,古代医家根据病情特点,有“骨痹”“鹤膝风”和“鼓槌风”等描述。《素问·痹论篇》中记载,“风、寒、湿三气杂至,合而为痹也”。可见,RA的病因病机为素体亏虚、复感外邪或痰瘀互结而致病[7-8]。羌活胜湿汤为金代医家李东垣的名方,主治痹症中的风湿痹阻证,具有较好的临床效果。羌活胜湿汤的主要功效为发汗祛风,除湿止痛。方中羌活、独活祛风湿,利关节,共为君药;防风、藁本祛风除湿,发汗止痛,共为臣药;川芎活血、祛风止痛,蔓荆子治头风疼痛,共为佐药;炙甘草调和诸药,为使药;诸药合用,具有祛风胜湿之效,可用于痹症中的风湿痹阻证[1-2]。

3.2 羌活胜湿汤治疗RA核心化合物分析

活性成分与靶点基因连接度值较高的化合物包括槲皮素、山柰酚、汉黄芩素、杨梅酮、β-谷甾醇、O-乙酰基二氢山芹醇和香叶木素等,上述活性成分可能是羌活胜湿汤治疗RA的关键成分。文献报道,槲皮素抑制中性粒细胞浸润,降低血浆炎症细胞因子水平,通过抑制中性粒细胞的活性来改善RA小鼠的炎症[9];槲皮素在RA中IL-17产生的破骨细胞生成中有免疫调节功能[10]。山柰酚通过阻断MAPK通路的激活而抑制RA成纤维细胞样滑膜细胞(RA-FLS)的迁移和侵袭,而不影响肿瘤坏死因子α(TNF-α)受体的表达[11]。汉黄芩素显著降低小鼠关节炎评分,增加体重,减少爪子厚度,显著提高红细胞和血红蛋白水平,降低白细胞计数和血沉率,显著改善氧化应激标志物、抗氧化蛋白和炎症细胞因子水平,并靶向NF-κB/MAPK信号通路改善完全弗氏佐剂诱导的RA[12]。β-谷甾醇对巨噬细胞具有免疫调节作用,对RA具有抗炎作用[13]。研究发现,香叶木素可使风湿性关节炎成纤维细胞凋亡率升高,减少TNF-α诱导的IL-1β、IL-6、IL-8和基质金属蛋白酶(MMP)1生成,通过调节蛋白激酶B和NF-κB信号通路,对TNF-α刺激的RA-FLS具有抗增生和抗炎作用[14]。O-乙酰基二氢山芹醇是独活中的活性成分,查阅文献发现尚无其治疗RA的研究,分子对接可以看出其与MAPK1连接度最好。MAPK1是MAPK家族成员之一,MAPK是生物体内重要的信号转导系统之一,MAPK参与各种生物反应如细胞增殖、分化、凋亡和入侵[15]。MAPK能被多种炎症介质激活,并调控炎症的发生、发展,通过抑制MAPK通路能抑制多种炎症因子的产生,从而阻止炎症反应[16];有研究表明,MAPK1是RA治疗药物的重要作用靶点[17],这可能是O-乙酰基二氢山芹醇作用于RA的重要靶点。

图4 BP富集分析图Fig 4 BP enrichment analysis diagram

图5 CC富集分析图Fig 5 CC enrichment analysis diagram

图6 MF富集分析图Fig 6 MF enrichment analysis diagram

图7 羌活胜湿汤与RA的富集分析Fig 7 Qianghuo Shengshi decoction-RA enrichment analysis diagram

图8 靶点-信号通路网络图Fig 8 Target signal pathway network

图9 羌活胜湿汤活性成分-RA靶点结合能热图Fig 9 Qianghuo Shengshi decoction active components-RA target binding energy heat map

A.槲皮素-MAPK1;B.O-乙酰基二氢山芹醇-MAPK1;C.汉黄芩素-STAT3;D.β-谷甾醇-STAT3;E.汉黄芩素-MAPK1;F.香叶木素-MAPK1。A.quercetin-MAPK1; B.O-acetyldihydrocarinol-MAPK1; C.wogonin-STAT3; D.β-sitosterol-STAT3; E.wogonin-MAPK1; F.diosmetin-MAPK1.图10 活性成分与靶点分子对接图Fig 10 Molecular docking diagram of active components and targets

3.3 羌活胜湿汤治疗RA核心靶点分析

PPI网络中,靶点之间连接度值越高,靶点基因潜在的治疗作用也越大,STAT3、JUN、RELA、MAPK1和MAPK14是度值排序居前5位的靶点基因,可能是关键靶点,其与活性分子对接较好,构象稳定。RA-FLS中microRNA的异位表达与RA的发生有关,miR-140是增殖和凋亡的关键调节因子,STAT3的表达可恢复miR-140的作用,使其能够调节RA-FLS的增殖、凋亡以及炎症细胞因子产生[18]。通过Mepe启动子上潜在的JUN结合位点可调节成骨细胞中JUN的转录[19]。RELA是NF-κB通路的关键亚单位,参与成骨细胞和软骨细胞的存活和分化,促进间充质干细胞增殖,但抑制成骨和软骨的分化[20]。

3.4 羌活胜湿汤治疗RA相关通路分析

RA是一种与慢性炎症相关的自身免疫性疾病,可损伤关节及其他器官,包括心脏、肾脏、肺、消化系统、眼睛、皮肤和神经系统等[21-22]。RA的发生、发展与免疫炎症反应密不可分,KEGG富集分析结果表明,羌活胜湿汤主要通过对氧化应激反应、炎症反应的调节和破骨细胞分化凋亡等方面,包括IL-17信号通路、NOD样受体信号通路、NF-κB信号通路、Toll样受体信号通路、Th17细胞分化、趋化因子信号通路和MAPK信号通路等信号通路发挥作用。(1)IL-17是高度通用的促炎细胞因子,在多种自身免疫性疾病中高表达,对于宿主防御、组织修复和炎症相关疾病的发病机制等多种过程发挥着重要作用,IL-17A诱导SHP2高表达,随后形成IL-17R-Act1-SHP2复合物,介导IL-17R信号自激活,IL-17的自主活化维持炎症和促进疾病进展[23]。(2)NF-κB是转录因子,调控细胞增殖凋亡以及炎症和免疫反应的基因表达,经典的NF-κB信号传导途径阻断生长激素或胰岛素样生长因子信号传导,抑制细胞增殖,抑制骨形态发生蛋白2表达,从而促进细胞凋亡。经典NF-κB信号通路可调节TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17等自身抗体和炎症细胞因子表达,使其在RA患者中表达升高,NF-κB抑制剂可用来抑制RA模型的炎症和关节的破坏,因此,NF-κB是控制软骨正常发育和病理破坏的重要分子[24-25]。(3)研究表明,Toll样受体及其配体的功能可能调节RA滑膜中下列因子的表达,如TNFα、IL-6和IL-8、血管内皮生长因子,以及影响MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-13的自发性产生,Toll样受体信号通路可能参与RA炎症及病变过程[26]。(4)NOD样受体信号通路是细胞凋亡和早期发育的关键调节因子,与感染和免疫相关疾病存在密切关系,在痛风、冷吡啉相关周期性综合征和克罗恩病等疾病中发挥重要的作用[27]。

综上所述,本研究基于网络药理学和分子对接方法探讨了羌活胜湿汤治疗RA的分子机制,发现羌活胜湿汤中多种活性成分通过多通路、多靶点协同治疗RA,可为其治疗RA的深入研究及临床应用提供科学参考与依据。