不同粗料组成对泌乳中后期奶牛瘤胃菌群与瘤胃发酵参数的影响

赵晓静， 刘嫣然， 李晓辉， 张 峰， 高艳霞，左晓磊， 王晓芳， 何团拥， 孙凤莉 ， 张建设， 申 栋

（1.保定职业技术学院畜牧兽医系，河北保定 071051；2.河北省畜牧兽医研究所，河北保定 071000；3.正定县南楼乡农业综合服务中心，河北正定 050800；4.河北省农林科学院粮油作物研究所，河北石家庄 050000；5.河北农业大学动物科技学院，河北保定 071000；6.石家庄市畜产品和兽药饲料质量检测中心，河北石家庄 050041；7.石家庄市藁城区畜牧工作总站，河北藁城 052165）

饲料是奶牛生存和生产的物质基础，尤其是优质的粗饲料，是奶牛重要的营养来源，对于维持奶牛瘤胃健康、提高饲喂效果和乳品质均有重要的作用。 然而，随着饲料原料价格的大幅度上涨，尤其是优质苜蓿价格居高不下，牧场经营压力增大。运用动物营养学原理，优化日粮设计，可减少高价苜蓿干草的用量。要达到良好的饲喂效果，必须能够稳定或优化瘤胃内环境，改善瘤胃发酵。 瘤胃是奶牛发挥生产性能的关键，瘤胃微生物与奶牛是共生关系，奶牛瘤胃为数量庞大的微生物菌群提供了理想的环境。瘤胃内的微生物是消化植物纤维的主要贡献者，其数量和种类受年龄（彭科兰等，2019）、饲养方式（沈芳等，2022；杨硕等，2020）、 饲料种类、 饲喂制度 （李建国，2012）等诸多因素的影响，瘤胃内环境与奶牛采食的日粮组成和结构密切相关，改善优化瘤胃微生物菌群可以提高反刍动物生产中瘤胃发酵和饲料利用的效率。

目前， 对瘤胃菌群与瘤胃发酵调控的研究主要包括甘露寡糖（郭婷婷等，2018）、低聚异麦芽糖（郭成等，2018）、果寡糖（胡丹丹等，2018）等益生元的使用，酵母培养物（Carpinelli 等，2021；Halfen等，2021）等益生菌（刘程等，2020）的使用及中草药（任曼等，2022；潘龙等，2015）作为绿色添加剂的使用，此外也有一些关于发酵粗饲料的使用（谢建林等，2021）。 关于不同精粗比日粮的研究及不同饲草型日粮对瘤胃菌群影响及效果主要集中在对羊的研究上（霍俊宏等，2020），在奶牛上的研究相对较少。 燕麦干草和苜蓿干草是当前奶牛养殖中两种常用的优质粗饲料，在相同饲养标准下，饲草类型不同的日粮纤维组成以及含量不同， 进而调控瘤胃微生态环境，会引起生产性能的差异（程思源，2022）。因此，本研究采用三种不同粗料组成的TMR 日粮配方来饲喂泌乳中后期奶牛，以燕麦干草组合过瘤胃赖氨酸、 蛋氨酸添加剂替代部分高质量苜蓿干草， 补充蛋白质的不足， 平衡氨基酸， 探讨替代方案条件下对奶牛瘤胃微生物菌群和原虫构成及其丰度、瘤胃发酵参数的影响，旨在为规模化牧场实现低（无）苜蓿日粮的精准营养、精细饲喂提供指导和参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验设计 本试验选用健康的泌乳中后期荷斯坦奶牛45 头，在牛场原有分群基础上，按照产奶量、胎次、泌乳天数相近的原则，分为3 组，每组15 头牛（每组15 个重复，每个重复1 头牛），试验分组及处理见表1。

表1 试验分组及处理

1.2 饲养管理与日粮组成 饲养试验于2021 年11 月16 日至2022 年1 月18 日在河北冀丰动物营养科技有限责任公司进行，预饲期7 d，试验期56 d。各组奶牛采用相同的饲养管理模式，均采用散栏式饲养，每日于06:00 和18:00 两次饲喂全混合日粮（TMR），自由采食，投料量根据剩料量调整，按采食量的105% 投料；每天推料，自由饮水；每日于06:00 和18:00 两次挤奶。

试验前采集各饲料原料， 进行实验室常规养分检测，参照NRC 2001 标准配制TMR，三个试验组TMR 组成及营养水平见表2。

表2 各试验组奶牛TMR 组成及主要营养水平

1.3 样品采集与测定 每组选择奶牛5 头，于试验结束当天晨饲前， 使用瘤胃液采样器采集瘤胃液， 用灭菌的4 层纱布进行过滤， 瘤胃液分为5份，1 份现场测定pH，使用Denver UB-7 型pH 计测定；1 份分装于10 mL 灭菌离心管，冻存于液氮中，带回实验室于-80 ℃超低温冰箱中保存，用于瘤胃微生物菌群及原虫的测定， 应用16S rRNA基因测序技术测定瘤胃微生物菌群及原虫的构成及丰度；其余3 份也分装于10 mL 离心管，按下列要求处理好后于-20 ℃冰箱中保存，1 份加入6 mol/L 的HCl 用于氨态氮（NH3-N）的测定，NH3-N浓度参照Weatherburn 用比色法测定；其余2 份用于微生物蛋白（MCP）及挥发性脂肪酸（VFA）(包括乙酸、丙酸、丁酸）等瘤胃发酵指标的测定，MCP 浓度参照Makkar 等（1982）方法测定；VFA 浓度参考Erwin 等（1961）方法测定，计算总挥发性脂肪酸（TVFA）浓度和各VFA 的摩尔比例。

1.4 统计分析 试验数据采用Excel 2000 进行平均值及标准差的计算， 数值用 “平均值±标准差”的形式表示；再用IBM SPSS Statistics 20 软件中分析/一般线性模型/单变量进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同粗料组成对泌乳中后期奶牛瘤胃微生物菌群的影响

2.1.1 门水平 不同粗料组成对泌乳中后期奶牛瘤胃微生物菌群在门水平相对丰度的影响见表3。三组试验牛瘤胃液中检测到的数量前10 的菌门，包括拟杆菌门、厚壁菌门、纤维杆菌门、螺旋体属、变形菌门、SR1、Tenericutes、TM7、Verrucomicrobia、蓝藻细菌。 三个试验组样品中所含的细菌门主要为拟杆菌门、厚壁菌门和纤维杆菌门，均占到了总细菌的90%以上。 与苜蓿组对比，过瘤胃氨基酸组和燕麦组有提高拟杆菌门丰度的趋势， 燕麦组厚壁菌门丰度明显降低（P < 0.05），其他各组间差异不显著（P > 0.05）；对蓝藻细菌丰度的影响，过瘤胃氨基酸组显著高于苜蓿组（P < 0.05），燕麦组极显著高于苜蓿组（P < 0.01），过瘤胃氨基酸组与燕麦组差异不显著（P > 0.05）；纤维杆菌门、螺旋体属、 变形菌门、SR1、Tenericutes、TM7、Verrucomicrobia 和其他菌群的丰度三个试验组均无显著差异（P > 0.05）。

表3 不同粗料组成对泌乳中后期奶牛瘤胃微生物菌群在门水平相对丰度的影响（top10） %

2.1.2 属水平 三组试验牛瘤胃液中检测到的数量前10 的属水平细菌相对丰度见表4。 可见，奶牛瘤胃中属水平的细菌中普雷沃氏菌属的丰度最高， 过瘤胃氨基酸组和燕麦组较苜蓿组有提高的趋势，但未达显著水平（P > 0.05）。 丁酸弧菌属丰度苜蓿组最高，显著高于燕麦组（P < 0.05），其他组间对比差异不显著（P > 0.05）。 琥珀酸菌属、纤维杆菌属、瘤胃球菌属、密螺旋体属、YRC22、Coprococcus、CF231 及梭菌科-梭状芽孢杆菌属的丰度差异均不显著（P > 0.05）。 除数量前10 的属水平细菌外的其他细菌总数显示， 苜蓿组含菌量显著优于燕麦组（P < 0.05），过瘤胃氨基酸组与苜蓿组和燕麦组差异均不显著（P > 0.05）；但在细菌数量上过瘤胃氨基酸组与苜蓿组接近。

表4 不同粗料组成对泌乳中后期奶牛瘤胃微生物菌群在属水平相对丰度的影响（top10） %

2.2 不同粗料组成对泌乳中后期奶牛瘤胃原虫的影响 不同粗料组成对泌乳中后期奶牛瘤胃原虫的影响见表5。 奶牛瘤胃内原虫主要是纤毛亚门。 结果显示， 瘤胃内纤毛亚门及其他原虫丰度在三个试验组间均无显著差异（P > 0.05），但过瘤胃氨基酸组较其他两组有升高的趋势。

表5 瘤胃原虫分类学组成分析

2.3 不同粗料组成对泌乳中后期奶牛瘤胃发酵参数的影响 由表6 可见， 三个试验组的奶牛瘤胃pH 差异不显著（P > 0.05），均在6.50 ~ 6.70，为正常范围。 NH3-N 浓度，过瘤胃氨基酸组和苜蓿组极显著优于燕麦组 （P < 0.01）；MCP 浓度苜蓿组最低，燕麦组极显著高于苜蓿组（P < 0.01），过瘤胃氨基酸组较苜蓿组有升高的趋势 （P >0.05）。 在TVFA 产量方面，过瘤胃氨基酸组极显著优于苜蓿组和燕麦组， 较苜蓿组和燕麦组分别增加52.71%和37.05%（P < 0.01）；在乙酸产量方面， 过瘤胃氨基酸组较苜蓿组和燕麦组分别增加52.32%和41.04%（P < 0.01）， 苜蓿组与燕麦组比较差异不显著（P > 0.05）；丙酸产量，过瘤胃氨基酸组> 燕麦组> 苜蓿组，过瘤胃氨基酸组和燕麦组极显著高于苜蓿组（P < 0.01），过瘤胃氨基酸组显著高于燕麦组（P < 0.05）；丁酸产量方面，过瘤胃氨基酸组显著高于苜蓿组和燕麦组（P < 0.05），苜蓿组与燕麦组无显著差异（P > 0.05）；戊酸产量方面， 过瘤胃氨基酸组极显著高于苜蓿组 （P <0.01），显著高于燕麦组（P < 0.05），苜蓿组与燕麦组差异不显著（P > 0.05）；异丁酸、异戊酸产量在各试验组差异均不显著（P > 0.05）。

表6 不同日粮组成对泌乳中后期奶牛瘤胃发酵参数的影响

3 讨论

3.1 不同粗料组成对泌乳中后期奶牛瘤胃微生物菌群的影响 奶牛瘤胃寄居着大量微生物，种类甚为复杂，主要有细菌、真菌（厌氧真菌）、原虫（纤毛虫）三大类，瘤胃微生物对食物分解和营养物质的合成起着极其重要的作用， 然而瘤胃菌群在一定程度上受到饲料种类、 饲粮组成和结构等众多因素的影响（Hao 等，2021）。本试验中奶牛瘤胃中优势菌门是拟杆菌门和厚壁菌门， 二者丰度占到瘤胃细菌总数的90%左右。 拟杆菌门、厚壁菌门、纤维杆菌门可降解饲料中的碳水化合物，拟杆菌门主要降解淀粉、 蛋白质和多糖等非纤维物质（Naas 等，2014），产生丙酸；厚壁菌门和纤维杆菌门促进胃肠道对纤维素分解，产生乙酸（La 等，2018）。 本试验中，拟杆菌门丰度燕麦组> 过瘤胃氨基酸组> 苜蓿组， 此趋势正好与日粮中NDF和FNDF 的含量趋势一致， 日粮中NDF 和FNDF浓度与瘤胃中拟杆菌门丰度的关系， 有待进一步研究。 瘤胃中厚壁菌门丰度苜蓿组显著优于燕麦组， 过瘤胃氨基酸组与苜蓿组厚壁菌门丰度差异不大， 说明过瘤胃氨基酸对奶牛瘤胃液中厚壁菌门的丰度影响不大。 纤维杆菌门的丰度燕麦组>苜蓿组> 过瘤胃氨基酸组，各组之间虽然差异不显著，但燕麦组偏高的NDF 可能是导致该菌数量增加的因素，因而更有利于降解纤维，这与胡丹丹等（2018）观点一致。 蓝藻菌门能进行产氧性光合作用，在本研究中，燕麦组丰度显著优于苜蓿组，过瘤胃氨基酸组与苜蓿组和燕麦组并无显著差异， 说明偏高NDF 日粮有利于蓝藻细菌的生长，这与霍俊宏等（2020）低精粗比日粮更利于蓝藻细菌生长的观点一致。

本试验中奶牛瘤胃中优势菌属是普雷沃氏菌属，祁有鹏等（2021）研究报道，普雷沃氏菌属是肉牛瘤胃菌群中的优势菌属，二者研究结果一致。该菌在本试验中三个试验组奶牛瘤胃中占到46.89%、44.31%和52.49%，其次是琥珀酸菌属、纤维杆菌属和瘤胃球菌属； 其他菌属丰度均低于2%。 普雷沃氏菌属可分解半纤维素、蛋白质和非纤维碳水化合物；瘤胃球菌、纤维杆菌属和产琥珀酸拟杆菌是重要的分解纤维素的细菌。 普雷沃氏菌属主要发酵产生乙酸、丙酸和琥珀酸；产琥珀酸拟杆菌分解纤维素产生琥珀酸，进而转化为丙酸。由于丙酸是主要的发酵产物之一， 反刍动物可由其得到葡萄糖作为能量物质以供机体利用。 纤维分解菌可在饲料进入瘤胃后的5 min 内植入植物碎片的表面，日粮中有足够氨的条件下迅速增殖，因而能够促进纤维粗饲料的有效利用。 丁酸弧菌属也是奶牛瘤胃中的纤维降解菌属， 在本试验中不是优势菌属， 苜蓿组该菌属丰度虽然表现出了优势，但与过瘤胃氨基酸组并无显著差异。

3.2 不同粗料组成对泌乳中后期奶牛瘤胃原虫的影响 奶牛瘤胃微生物区系及组成极为复杂，原虫主要是纤毛亚门， 其种类和数量受瘤胃内容物稀释率和外流速率、 饲粮类型等多种因素的影响。王梦芝等（2009）试验表明，日粮结构可改变瘤胃发酵，进而影响原虫种群结构和吞噬速率。原虫吞噬速率与日粮NDF 含量间呈三次方曲线关系，吞噬速率与细菌（原虫）密度呈负（正）相关关系，种属间差异显著， 有的随NDF 含量降低而增高，有的则相反。吐尔逊阿依·赛买提等（2018）研究表明， 高粗纤维饲粮可显著提高塔里木马鹿瘤胃原虫的活力， 不同纤维水平饲粮对瘤胃原虫总数影响不大。本试验结果表明，在NDF 相当的条件下，不同粗料组成的TMR 对瘤胃内纤毛亚门及其他原虫组成及丰度并未造成显著影响。 魏小兰等（2021）分析认为，瘤胃原虫对奶牛营养物质代谢有利有弊， 有利表现在纤毛虫能够稳定瘤胃pH，防止瘤胃酸中毒；原虫可利用纤维素，分解不溶性蛋白，改善蛋白品质，降低硝酸盐、亚硝酸盐致毒，预防动物中毒。 弊端在于原虫通过吞噬细菌和真菌合成氨基酸，使微生物的氮产量降低；原虫在奶牛反刍过程中与氧接触， 原虫的自溶代谢造成氮的无效循环；瘤胃发酵过程中增加了甲烷产量，加大了能量损失。杨宝钰等（2021）研究发现，原虫种属很多，数量呈凹凸形式变化，采食前奶牛瘤胃原虫数量相对较高，采食后稀释了胃内容物，原虫数量缓慢降低，新的可利用的营养物质进入瘤胃，原虫数量又增加，维持在一个动态范围内。 可见，对瘤胃原虫区系、种类、数量进行合理的控制，充分发挥原虫有利生理功能，能调控瘤胃发酵，改善生产性能。

3.3 不同粗料组成对泌乳中后期奶牛瘤胃发酵参数的影响 瘤胃液pH、NH3-N 和VFA 是评价饲料在瘤胃中发酵的重要参数。 瘤胃pH 容易受到日粮性质、采食后测定时间和环境温度的影响，pH 稳定在6.0 ~ 7.0， 为瘤胃发酵创造良好条件（李建国和高艳霞，2012）。饲料中碳水化合物以及含氮物质的降解主要由细菌（纤维降解菌）和原虫来完成。 本试验中， 各试验组奶牛瘤胃液pH 为6.50 ~ 6.70，在正常的范围之内，使纤维分解菌等微生物正常工作，可以保证良好的瘤胃发酵。

NH3-N 是利用饲料中蛋白质、非蛋白氮合成微生物蛋白（MCP）的重要中间物质，瘤胃内适宜的NH3-N 浓度有利于MCP 的合成。本试验中，过瘤胃氨基酸组和苜蓿组奶牛瘤胃中NH3-N 浓度极显著优于燕麦组，而燕麦组的MCP 极显著高于过瘤胃氨基酸组和苜蓿组，可能与燕麦组TMR 中相对较低的CP 和相对优势的拟杆菌门丰度有关，一方面TMR 中CP 低，瘤胃微生物分解产生的NH3-N 相对较少，另一方面通过优势拟杆菌降解淀粉、蛋白质等物质，大大提升了MCP 的合成效率。 过瘤胃氨基酸组和苜蓿组奶牛的NH3-N 浓度差异不显著，合成的MCP 浓度差异也不显著，可能与这两组TMR 中CP 稍高有关，瘤胃液中微生物将其降解为NH3-N，为瘤胃微生物提供较多的氮源。

VFA 是反刍动物对碳水化合物消化吸收的最终产物， 碳水化合物在奶牛瘤胃内被降解为单糖，再进一步降解为VFA，包括乙酸、丙酸、丁酸等及CO2、甲烷，再被瘤胃壁吸收被机体所利用。粗饲料发酵产生的乙酸比例较高，乙酸、丁酸是奶牛生成乳脂的主要原料； 精饲料发酵产生的丙酸较多，丙酸比例提高，会增加体脂肪沉积（李建国，2012）。本试验中，在TVFA 和乙酸、丙酸、丁酸、戊酸的产量方面， 过瘤胃氨基酸组均表现出了显著的优势，为奶牛提供更多能量。

4 结论

综上所述， 各试验组奶牛瘤胃液pH 稳定在正常范围之内，有利于瘤胃发酵。在门水平和属水平，三个试验组优势菌群的组成相同，只是菌的占比稍有差异， 过瘤胃氨基酸组和苜蓿组的优势菌群的相对丰度均优于燕麦组， 过瘤胃氨基酸组和苜蓿组的优势菌群差异不显著。在TVFA 和乙酸、丙酸、丁酸、戊酸的产量方面，过瘤胃氨基酸组均表现出了显著的优势。

在本试验条件下，综合评定认为，以燕麦干草组合过瘤胃赖氨酸、 蛋氨酸添加剂替代部分高质量苜蓿干草的TMR 日粮饲喂泌乳中后期奶牛，稳定了瘤胃菌群和瘤胃发酵微生态环境， 适当降低了干草质量， 用过瘤胃赖氨酸和蛋氨酸补充了蛋白质的不足，可以在生产中推广应用。