四株猪源乳杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

张誓育， 李 咏， 朱 润， 吴银宝， 米见对

（华南农业大学，广东广州 510642）

肠道微生物在新陈代谢和免疫耐受等众多生理过程中与宿主互利共生， 良好的菌群结构有益于宿主的肠道健康（支海美等，2022）。肠道菌群也是参与生物体营养代谢的重要成员， 一些本地优良品种的猪具有与其他猪种不同的肠道微生物菌群，对其进行粪菌移植后发现，其他猪种的猪也拥有了本地猪种的优良性能（Xiang 等，2020）。 肠道菌群也参与肠道形态的构建， 试验证明有一些菌种可以提高猪结肠紧密连接蛋白ZO-1 等的表达水平，保护肠道屏障、缓解炎症（Hu 等，2017）。 而畜禽养殖业中大量使用抗生素（丁撷瑛，2019），不仅会使动物体内的残留抗生素随粪便排出体外，影响食品安全、污染环境（张金飞，2017），而且会破坏动物肠道微生态平衡，诱发疫病（姚新年等，2019；胡秀香，2016）。促生长类抗生素在我国已被禁用，“无抗养殖”成为未来生猪养殖的发展趋势，因此，我们迫切需要寻找替代抗生素的产品。益生菌可以调控肠道微生态平衡、 维护肠道及宿主健康，是一种潜在的“抗生素替代品”。

乳杆菌属中一些菌株是公认安全的益生菌（GRAS），具有制成益生菌制剂的前景。 肠道内乳杆菌的增加可降低肠道pH，并能产生抑制有害菌群生长的抗菌物质，有效抑制有害菌的繁殖（徐文佳，2022；张国华等，2013）。 乳杆菌还能提高动物自身免疫能力，多角度发挥作用抵御病原体入侵。因此， 乳杆菌在益生菌的研究和生产中得到广泛应用（雷虹等，2017）。 研究表明，同源性乳杆菌对宿主的益生作用优于异源性菌群， 即理想的菌株应该来自同种动物的消化道 （Timmerman 等，2006），因此，分离猪源乳杆菌更有利于今后在养猪生产中的应用（Gardiner 等，2004；Scheppler 等，2002）。

故本研究从健康无抗饲喂的成年猪粪中分离出乳杆菌，进行16S rRNA 菌株鉴定，并检测其能否耐受胃部环境，综合其生长性能、抗逆性能、耐药性等多个方面的表现， 为实际生产中益生菌剂的开发提供后备菌株。

1 材料与方法

1.1 培养基及试剂配制 MRS 培养基： 蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，磷酸钾2 g/L，柠檬酸二铵2 g/L，乙酸钠5 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温80 g/L，七水硫酸镁（MgSO4·7H2O） 0.58 g/L，四水硫酸锰（MnSO4·4H2O）0.25 g/L，pH 5.5。

人工模拟的猪胃消化液及其制备方法： 将猪配合饲料和人工胃液按1 g：3 mL 的配比混合，调pH 至1.5 ~ 2.0，39 ℃振荡1 ~ 2 h， 冷却至4 ℃，8000 ~ 9000×g、4 ℃离心5 ~ 10 min，取上清液为人工模拟猪胃消化液。

人工胃液购自上海源叶生物科技有限公司。菌株生理生化鉴定管均购自海博生物技术有限公司和北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 菌株的分离与鉴定 采取广州某猪场未使用抗生素和未曾腹泻的成年猪粪， 密封于无菌采样袋后4 ℃下带回实验室进行菌株分离。 用无菌镊子取1 g 猪粪， 加入PBS 稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7， 取10-4、10-5、10-6、10-7这四个浓度梯度涂布平板，每个浓度梯度3 个重复。置于37 ℃厌氧培养48 h。对长出的菌落进行反复划线培养，获得单一菌落。

挑取白色疑似乳杆菌的单个菌落， 接种至MRS 肉汤培养基中，37 ℃厌氧培养24 h。 选用细菌基因组DNA 提取试剂盒 （Omega Bio-Tek，美国），采用细菌16S rRNA 通用引物：上游27F（5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'）；下 游 1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'） ， 引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。

PCR 反应体系 （25 μL）：2×Taq plus Buffer 12.5 μL，2 μL 模板DNA，上游、下游引物各1 μL，ddH20 8.5 μL。以ddH2O 作为阴性对照。PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循环35 次，72 ℃延伸10 min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，有合格条带后进行测序， 测序由上海生工生物技术服务有限公司完成。

将挑出的菌落接种至MRS 肉汤培养基中培养48 h， 取60 μL 培养后的肉汤滴于载玻片上。烘干后，依次加入结晶紫染色液染色1 min，再用革兰氏碘液染色1 min，丙酮乙醇混合液（丙酮：95%乙醇= 3：7）脱色30 s，最后经过沙黄染色液复染1 min， 在光学显微镜下观察 （黄建江等，2021）。参照《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版及《常见细菌系统鉴定手册》对上述菌株进行生理生化性质的鉴定。

1.3 菌株生长曲线的测定 分别取对数生长期菌液按2.0%的接种量接种于MRS 肉汤培养基中。 放入培养箱37 ℃静置培养，每0.5 h 取样测定四株乳杆菌吸光度（OD600），重复5 次取平均值绘制生长曲线。

1.4 测定菌株在模拟胃环境下的存活率 取对数生长期的四种乳杆菌， 以2%的接种量加入到人工模拟的猪胃液中，39 ℃培养4 h。在结束后分别取样1 mL，倾注法涂板计数，计算存活率，由此判断菌株能否通过胃环境进入受体肠道。

1.5 测定菌株耐酸性能 取对数生长期的四种乳杆菌，每株菌取两组各4 mL，离心（10000 r/min，5 min），弃上清，加入等量无菌水，无菌水分别调节pH 至2.5 和7.0，37 ℃培养2 h，按4%接种到MRS肉汤培养基中，培养20 h 后测定吸光度（OD600）。

1.6 测定菌株耐胆盐性能 与1.5 菌株耐酸性能测试的处理相同， 将添加的无菌水替换为无菌的0.1%、0.3%、0.5%胆盐溶液，操作同上，测定吸光度（OD600）。

1.7 测定菌株耐高温性能 取对数生长期的四种乳杆菌，以2%的接种量加入到MRS 肉汤培养基中，分别放置于50、80 ℃培养。 在0、30、60 min时分别取样1 mL，倾注法涂板计数，计算存活率，由此判断菌株耐热性能。 计算公式如下：

存活率/%=（高温处理后的培养基活菌数/未高温处理的培养基活菌数）×100。

1.8 测定菌株的耐药性 制备氨苄青霉素浓度为32 μ/mL 的MRS 肉汤培养基Ⅰ、硫酸卡那霉素浓度为64 μg/mL 的MRS 肉汤培养基Ⅱ、链霉素浓度为16 μg/mL 的MRS 肉汤培养基Ⅲ、强力霉素浓度为16 μg/mL 的MRS 肉汤培养基Ⅳ各100 mL。 分别取对数生长期菌液按2.0%的接种量接种于上述四种MRS 肉汤培养基中。 放入培养箱37 ℃静置培养， 每0.5 h 取样测定四株乳杆菌吸光度（OD600），重复5 次取平均值，绘制生长曲线。

1.9 数据分析 试验数据采用SPSS 18.0 软件进行统计学分析，对每组数据进行正态性检验，符合正态分布则采用单因素方差分析 （One-Way ANOVA），方差齐则采用LSD 检验，若方差不齐则采用Games-Howell（A）检验；以P ＜0.05 为差异具有统计学意义，P ＜0.01 为极显著差异，数据结果以“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离与鉴定 本试验从未腹泻且未用抗生素的成年猪直肠内容物中分离纯化菌株，继而进行革兰氏染色， 得到革兰氏阳性的4 个菌株，分别命名为SYgz1119，KNgz0128，HYgz0212，ZLgz1227，将这四株乳杆菌与参考菌株进行比对，绘制出进化树。 如图1 所示， 结果显示菌株SYgz1119 归属于敏捷乳杆菌 （Lactobacillus agilis）；KNgz0128 归属于香 肠乳杆菌（Lactobacillus farciminis）； 菌株HYgz0212 归属于嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）； 菌株ZLgz1227 归属于约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）。

图1 菌株序列的进化树分析

对这四株菌进行生理生化特性的鉴定。 所用生化鉴定管有硝酸盐还原生化管、 纤维二糖生化管、果糖生化管、半乳糖生化管、乳糖生化管、葡萄糖生化管、麦芽糖生化管等31 种生化管，结果如表1 所示。 生理生化管的结果验证了16S rRNA的结果，分离出的四种菌分别归属于Lactobacillus agilis；Lactobacillus farciminis；Lactobacillus acidophilus；Lactobacillus johnsonii。

表1 四株菌的生理生化特性

2.2 菌株的生长曲线 如图2 所示，ZLgz1227 在0 ~ 10 h 总体生长迅速，2 h 后进入对数生长期，12 h 后进入平台期。 KNgz0128 在0 ~ 10 h 总体生长迅速，2 h 后进入对数生长期，12 h 后进入平台期。 HYgz0212 在0 ~ 20 h 总体生长较为迅速，4 h 后进入对数生长期，20 h 后进入平台期。SYgz1119 在0 ~ 8 h 总体生长迅速，1 h 后进入对数生长期，8 h 后进入平台期。 这四株菌生长趋势接近，生长最迅速的是SYgz1119，最快到达对数生长期和平台期。

图2 四株菌的生长曲线

2.3 菌株在模拟胃环境下的存活率 猪胃的pH在0.9~1.5，强酸性环境可能会破坏菌株的结构和功能，导致活菌数大幅降低，影响其在胃肠道发挥作用。由图3 可知，ZLgz1227 在模拟胃环境下4 h后存活率为132.29%；KNgz0128 在模拟胃环境4 h后存活率为21.73%；HYgz0212 在模拟胃环境4 h后存活率为127.31%；SYgz1119 模拟胃环境4 h 后存活率为87.99%。 ZLgz1227、HYgz0212、SYgz1119都有较好的过胃能力， 不会被胃液破坏，而KNgz0128 存活率较低，说明其很可能会在胃环境内被破坏， 难以在肠道内定植发挥作用。 其中ZLgz1227 的存活率最高， 分别比KZgz0128、SYgz1119、HYgz0212 高出110.56、44.3、4.98 个百分点，拥有最强的过胃能力。

图3 四株菌的过胃存活率

2.4 菌株耐酸耐胆盐性能 在培养20 h 后，测量、记录吸光度（OD600），将吸光度统一调至1.5。在接入不同培养基培养2 h 后记录吸光度（OD600），并对各株菌的数值进行差异显著性分析。 由表2数据可知， 这四株菌在pH 2.5 时都能较为正常的生 存， 吸 光 度 均 在1.4 以 上；KNgz0128 和HYgz0212 都对0.1%的胆盐不耐受，ZLgz1227 和SYgz1119 能在0.1%的胆盐浓度下正常生长；胆盐浓度为0.3%时，KNgz0128 和HYgz0212 都无法正常 生 长， 吸 光 度 都 在0.4 以 下，ZLgz1119 和SYgz1119 表现出较好的适应能力；0.5%的胆盐浓度下， 仅有ZLgz1227 表现出较好的适应能力，HYgz0212、KNgz0128、SYgz1119 均不能正常生长。

表2 4 株四株菌的耐酸耐胆盐性能

2.5 菌株耐高温性 在80 ℃和50 ℃这两种不同温度环境下培养四株菌，在80 ℃培养时，四种菌株都难以存活，培养30 min 后稀释涂板，存活率均低于1‰，培养60 min 后稀释涂板，未有活菌长出， 由此可见这四株菌均不耐80 ℃的高温。在实际应用时需要避免过高的温度防止菌株失活。如图4 所示，在50 ℃培养时四株菌均能存活，存活率相差较大：ZLgz1227 在50 ℃处理30 min后能有65.78%的存活率，在50 ℃处理60 min 后有77.11%的存活率，存活率高于处理30 min 时，这可能是有一些单菌被驯化后能够适应50 ℃的高温， 存活甚至繁殖。 KNgz0128 与ZLgz1227 类似，50 ℃处理30、60 min 后存活率分别为5.31%和10.41%， 提示这两株菌可能有耐高温的潜力。SYgz1119 在50 ℃处理30 min 后存活率高达185.47%，这说明这段时间SYgz1119 进行了增殖，而在50 ℃处理60 min 后，存活率降至175.51%，这表明该乳杆菌可能能够忍受短时间的50 ℃高温， 长期暴露于这样的温度下仍旧会影响其生存繁殖。HYgz0212 与之类似，50 ℃处理30 min 后存活率达147.48%，而在50 ℃处理60 min 后，存活率降至109.22%。

图4 四株菌的耐高温性能（50 ℃）

2.6 菌株耐药性 对分离出的四株乳杆菌进行耐药性检测， 选用了现阶段畜牧养殖业常用的几种抗生素：氨苄西林、卡那霉素、链霉素、强力霉素，他们分别属于β-内酰胺类，氨基糖苷类（卡那霉素、链霉素），四环素类抗生素。 由图5 可知，这四株菌中，ZLgz1227 对氨苄西林耐药性最弱，吸光度维持在0.82， 几乎无法在氨苄西林胁迫下生存，而HYgz0212 对氨苄西林耐药性较强，吸光度达到了1.7；SYgz1119 对卡那霉素、链霉素、强力霉素的耐药性略强于其他三株菌， 吸光度基本都达到了3.0。 这四株菌普遍不耐氨苄西林，对卡那霉素、链霉素、强力霉素都有一定的耐药性。

图5 四株菌对几种常用抗生素的耐药性

3 讨论

这四株菌都能发酵部分糖类， 生理生化特性相近。 SYgz1119 是这四株菌中生长最快的菌，最快到达平台期。 耐酸耐胆盐的能力关系到菌株过胃的能力， 影响之后在动物体内的定植成功率（Mu 等，2018），故而这项指标亦有较高的参考价值。菌株如果被胃酸分解破坏就无法发挥其作用，所以本试验进行了体外过胃模拟试验， 结果显示在模拟胃液处理4 h 后， 四株菌都能存活，除KNgz0128 之外的三株菌都生长良好，说明后续在实际应用时这些菌株均能通过胃部， 进入猪的肠道发挥作用。 胆盐耐受性是益生菌能发挥作用的必要条件之一， 四株菌株对0.1%的胆盐耐受，对0.3%的胆盐有一定的耐受性，对0.5%的胆盐不耐受。 而正常动物小肠中的胆盐浓度为0.03% ~0.3%（戴青等，2008）， 这说明这四株菌都有制作成猪益生菌产品的潜力。

已有研究表明，嗜热链球菌、鼠李糖乳杆菌和动物双歧杆菌含有三重耐药基因 （梁媛媛等，2022），本研究中HYgz0212 对氨苄西林有较强的耐药性，对卡那霉素、链霉素、强力霉素都有较强的耐药性， 实际运用后可能会带来抗生素抗性基因的传播风险。SYgz1119 对卡那霉素、链霉素、强力霉素的耐药性略强于其他三株菌， 也有较高的抗生素抗性基因传播风险。 在实际生产时也要考虑到耐药菌带来的危险，严格控制剂量。

在50 ℃处理30、60 min 后四株菌均有较高的存活率， 说明这四株乳杆菌能接受50 ℃的高温，而温度升高至80 ℃时，四种菌株很快就全部死亡，说明这些菌不耐高温，在后续应用时，如果需要对菌株进行加工制成菌剂， 要控制好温度以免破坏菌株活性。

在寻找能够替代抗生素的优良菌株， 乳杆菌作为早就被批准添加的益生菌成功进入了人们的视线（李国建，2022），国内外有很多分离猪源乳杆菌的研究，约氏乳杆菌、加氏乳杆菌、植物乳杆菌、短乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等（吴雨晗等，2022；曹海鹏，2021）， 这说明乳杆菌是广泛分布在猪消化道中的。已有研究在人类身上证实，某些乳杆菌可以帮助重建肠道微生物生态平衡， 恢复患者胃肠功能（钟碧莹，2022），这提示外源添加从健康、抗逆性强的猪消化道中分离出的乳杆菌， 可能起到调节受体消化道内菌群结构的作用， 有针对性的粪菌移植可以用于预防肠道疾病，修护肠道屏障，降低使用抗生素带来的危害。

4 结论

本试验从健康、未腹泻、未使用抗生素的成年猪 直 肠 中 分 离 出 SYgz1119、KNgz0128、HYgz0212、ZLgz1227 这四株菌， 分别归属于Lactobacillus agilis；Lactobacillus farciminis；Lactobacillus acidophilus；Lactobacillus johnsonii。 综合各项指标的检测结果，ZLgz1227 有更优的性能，实际生产中可以考虑对其加以利用。