中期胃癌患者根治术后复发情况与术前LETM1、TIMP-1表达的关系研究

万云杰 夏甘树 王子铭 张志忠

作者单位：455000 河南省安阳市肿瘤医院

胃癌是临床常见消化道肿瘤,具有较高的病死率。且近年来在我国发病率不断上升,已成为威胁我国居民生命安全的重要因素[1]。胃癌中期即Ⅱ～Ⅲ期,是治疗胃癌的重要阶段,胃癌根治术则是治疗胃癌的主要方式。该阶段采用胃癌根治术虽具有可观的治疗效果,帮助延长生存时间,而部分患者受病程、分化程度等因素影响,仍伴有胃癌复发的风险[2]。但是由于尚无有效指标可预测胃癌根治术后患者是否复发,导致难以提前制定治疗计划,控制病情发展。因此,寻找可用于预测胃癌根治术后是否复发的相关指标已成为临床热点话题。得益于近年来免疫组织化学等领域的发展,多种蛋白物质的出现并在肿瘤领域的广泛应用为临床提供新的思路,其中基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-1)在肿瘤诊断及评估等方面获得广泛运用,而亮氨酸拉链EFhand结构域跨膜蛋白1(LETM1)亦成为评估预后等方面的重要参考方面,但是关于两种物质联合检测能否用于预测中期胃癌根治术后复发状况尚不可知,且相关报道亦较为有限,基于此,本次尝试探究中期胃癌根治术后复发状况与LETM1、TIMP-1联合检测的联系,希望为临床提供经验及参考,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2016年11月至2019年5月于我院进行胃癌根治术的Ⅱ～Ⅲ期胃癌患者102例。男性68例,女性34例;年龄43～64岁,平均年龄(54.84±3.17)岁;高分化59例,中分化31例;低分化12例;弥漫型胃癌48例,肠型39例,混合型胃癌15例;Ⅱ期61例,Ⅲ期41例。

纳入标准:①经相关检查后,符合《中国早期胃癌筛查及内镜诊治共识意见(2014年,长沙)》[3]中胃癌相关诊断标准者;②TNM分期[4]Ⅱ～Ⅲ期者;③首次确诊者;④计划行胃癌根治术者;⑤预计治疗方案相似者;⑥临床资料齐全者。

排除标准:①伴有器官功能障碍或衰竭者;②伴有凝血、免疫系统疾病者;③伴有其他部位恶性肿瘤者;④术前行其他治疗者;⑤伴有其他消化系统疾病者。

1.2 方法

①亮氨酸拉链EFhand结构域跨膜蛋白1(LETM1)检测:于患者胃癌根治术前,取病灶及癌旁正常组织,固定后使用石蜡进行包埋;制成3～6 μm切片后,进行水化、冲洗等操作,5～10 min/次,2～3次/片,随后在缓冲液中提高温度至100 ℃,维持8～10 min,后待切片冷却行冲洗、孵育等操作,并加入LETM1抗体稀释液100 μL,随后在3 ℃～5 ℃环境下存放8～10 h,再加入聚合物辅助剂,再次孵育,磷酸缓冲液冲洗3次,并进行显色、复染、冲洗等操作后进行封片,随后进行观察。②基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-1)检测:于术前取标本,固定后行包埋,制成3～6 μm切片,并ABC免疫组化染色法进行染色,使用上海羽哚生物科技有限公司生产免疫组化试剂盒观察TIMP-1状况。两组检测结果均由3名5年以上经验的相关医师进行评估及预测。

1.3 评估标准

LETM1评估标准:依据观察细胞着色强度及阳性占比对LETM1进行分级,若无明显阳性细胞或染色程度均好,可记作阴性-,观察阳性细胞数<25%,或存在棕黄色颗粒,则记作+,若观察内阳性细胞数量≥25%且<50%,颗粒为黄色或棕黄色,则记作++;若观察内阳性细胞数量≥50%,且均有深棕色则记作+++。若患者观察为-或+,则可记作LETM1低表达,若患者观察为++或+++,则记作LETM1高表达。

TIMP-1状况评估:观察切片内阳性细胞数量及染色状况,依据乳腺癌阳性切片作为阳性标准,以浓度为0.05 μmol/L的 磷酸盐缓冲溶液进行染色作为阴性参考标准。若切片中细胞阳性率≥20%,则记作阳性,若切片中阳性细胞率<20则记作阴性病例。

复发评估标准:若术前检查LETM1高表达或TIMP-1阳性,则可记作可能复发。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 LETM1预测结果比较

经统计,术后2年内胃癌复发57例(55.88%),未复发45例(44.12%)。其中LETM1阳性65例患者中,共有48例(73.85%)复发,17例(26.15%)未复发;LETM1阴性37例患者中共有9例(24.32%)复发,28例未复发(75.68%);TIMP-1阳性共63例,46例(73.02%)复发,17例未复发(26.98%);TIMP-1阴性共有39例,其中11例(28.21%)复发,28例未复发(71.79%),见表1。

表1 LETM1预测结果比较(例,%)

2.2 联合检测预测效能比较

联合检测预测3年内复发71例(69.61%),无复发31例(30.39%),见表2、表3、图1。

图1 LETM1、TIMP-1预测胃癌根治术后复发状况ROC曲线

表2 联合检测预测效能比较/例

表3 LETM1、TIMP-1联合检测预测效能分析

2.3 不同生存时间患者相关表达比较

术后3年内,共有53例死亡,剩余生存49例。LETM1高表达共54例,其中43例(79.63%)生存时间<3年,11例(20.37%)生存时间≥3年;LETM1低表达共48例,其中10例(20.83%)生存时间<3年,38例(79.17%)生存时间≥3年;TIMP-1阳性共有62例,其中46例(74.19%)生存时间<3年,16例(25.81%)生存时间≥3年;TIMP-1阴性共有40例,其中共有7例(17.50%)生存时间<3年,33例(82.50%)生存时间≥3年。

3 讨论

胃癌是临床常见恶性肿瘤,由于临床对于发病机制尚未完全明晰,临床多以胃癌根治术进行治疗,但是受患者病程、免疫能力、基础疾病等因素影响,具有较高的复发率。但是对于胃癌根治术后是否复发临床暂无有效方式进行预测。因此寻找相关指标对胃癌根治术后复发状况进行预测并提前予以治疗已成为临床重点研究方向,伴随近年来免疫组织化学的快速发展,LETM1、TIMP-1的出现及在多种癌症中的广泛应用为临床医护人员提供新的思路。

本次研究就两组患者联合预测准确率展开统计,发现联合检测并预测复发率具有较高准确性,推测与LETM1、TIMP-1的性质有关。LETM1蛋白属于EF臂钙离子结合蛋白,在机体内具有多种表达方式,亦是影响线粒体正常功能、维持线粒体形态、渗透压的重要因素[5]。由于胃癌组织的生长发育需要较多的物质,因此胃癌组织周围常伴有丰富的小血管,故线粒体数量同样较高,而LETM1作为参与癌症发生发展的重要因素及线粒体中常见物质[6],亦具有较高的表达,故复发患者中LETM1多以高表达形式呈现,表示胃癌组织仍具有充足的营养物质及再次发生的可能。刘伟昌等[7]在研究中发现,LETM1高表达可能加快中原癌基因(c-myc)等基因转录速度,并激活其他信号通路,达到促进恶性肿瘤细胞分裂、增殖甚至迁移的进程,进一步提高复发风险。陈乐乐等[8]学者亦在报道中指出,LETM1可通过调节PI3K/Akt信号及胃癌组织周围细胞,参与胃癌发生发展进程,提高复发率。TIMP-1是可通过活化间质胶质酶等物质的低分子量蛋白,亦具有抑制基质金属蛋白酶(MMPs)的功能[9]。如抑制基质金属蛋白酶-9(MMP-9)等,MMP-9是常见肿瘤标志物,不仅可影响细胞外基质的降解进程,还可增强肿瘤浸润能力,且与肿瘤发生发展密切相关[10],是影响复发、转移的重要因素。TIMP-1则是以蛋白酶共价结合的形延缓甚至避免水解,达到抑制肿瘤细胞的作用[11]。许林波等[12]在报道中指出,TIMP-1可与MMP-9进行结合,降低MMP-9活性。而MMP-9活性降低可阻碍胃癌发生发展的作用,TIMP-1表达亦可能受MMP-9活性降低影响,呈现出高表达,打破TIMP-1与MMP-9的平衡,导致癌细胞侵袭能力增强,影响复发[13],而当TIMP-1处于高表达时,多以阳性进行表达,此时TIMP-1可激活血管内皮因子(VEGF)、丝裂素活化蛋白激酶(MAKP信号通路),引起肿瘤细胞增殖速度加快并在快速传播下,进一步提高复发风险[14]。

本次研究还对联合检测能否预测生存时间展开比较,发现亦生存时间<3年同样与TIMP-1阳性、LETM1高表达的有关,其根本原因是两种检测结果是胃癌发生发展及转移的重要参考。一方面,TIMP-1阳性、LETM1高表达患者在胃癌根治术后具有较高的复发率,可能直接影响患者生存时间。另一方面,LETM1高表达,不仅表示胃癌组织周围具有较充足的能量及营养,还可能因LETM1 mRNA激发部分信号通路,加快胃癌细胞增殖,增强胃癌细胞恶性生物学行为[15],进而增强胃癌对患者威胁,缩短生存时间。孙国岩等[16]学者也发现,TIMP-1表达水平较高常表示预后较差,与本次研究结论类似。

综上所述,LETM1、TIMP-1联合检测可帮助中期胃癌患者预测胃癌根治术后复发状况及生存时间,具有临床价值。