辐照红细胞与普通悬浮红细胞输注对肝癌患者CD4+T细胞亚群水平的影响

王云鹏 张新蔚 吕旭方 马宝亮 李小全 魏书堂 徐 丽

肝癌患者经及时治疗,其5年生存率通常较高,临床常以手术切除做为治疗早期肝癌的首选方案,但肝组织减少、凝血因子减少等原因,影响患者凝血能力,因此围术期需适当使用异体输血辅助治疗[1]。但异体输血中部分白细胞、细胞因子等活性成分可能抑制肝癌患者细胞免疫功能,增加患者感染风险和死亡风险,可能影响患者生存期[2]。目前有研究发现,血液制品经定量射线辐照后,血液中具有免疫活性的T淋巴细胞会丧失植活、增殖能力,失去其免疫反应,可有效预防输血相关性宿主疾病,但在肝癌患者中相关研究报道较少[3]。对此,本次研究回顾性分析辐照红细胞与普通悬浮红细胞输注对肝癌患者CD4+T细胞亚群水平的影响,现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2018年5月至2020年5月我院收治的100例肝癌患者,根据输血红细胞类型,将以辐照红细胞输注治疗的65例患者纳入辐照组,以普通悬浮红细胞输注治疗的35例患者纳入普通组。

纳入标准:经病理活检诊断为肝癌[4];临床分期为Ⅰ、Ⅱ期[5];术前凝血功能正常;符合肝癌手术指征;存在术后血红蛋白(Hb)<70 g/L等输血指征;术前无放化疗史;近期无激素治疗史;近期无输血史。

排除标准:术前合并感染;临床资料不全;术中输血量少且术后凝血功能正常;术前严重贫血。

辐照组中性别(男/女):35/30例;年龄38～61岁,平均(50.02±4.98)岁;肝癌分期:Ⅰ期36例,Ⅱ期29例;病理检查结果:肝细胞型53例,胆管细胞型12例;肿瘤最大直径平均(3.12±0.58)cm;术前Hb水平平均(115.29±7.05)g/L。

普通组中性别(男/女):19/16例;年龄36～62岁,平均(49.58±5.07)岁;肝癌分期:Ⅰ期20例,Ⅱ期15例;病理检查结果:肝细胞型29例,胆管细胞型6例;肿瘤最大直径平均(3.07±0.56)cm;术前Hb水平平均(113.98±7.01)g/L。

两组患者一般资料比较无明显差异(P>0.05)。

1.2 治疗方法

普通组患者以普通悬浮红细胞输注治疗;辐照组患者以辐照红细胞输注治疗,辐照射线为137Cs γ射线,辐照剂量为25 Gy。2组患者输血量根据患者个体情况设置为2～4IU,均为悬浮红细胞,未输入血浆等其他成分。

1.3 指标检测方法

外周血CD4+T细胞亚群水平检测:①Th1、Th2:2组患者分别于输血前、输血后14 d时采集肝癌患者血液样本,以肝素抗凝处理后保存,检测时取分别0.5 ml血液样本,加入等量刺激溶剂,输血前样本放入对照管中,输血后14 d样本放入试验管中,加入10 μl的流式抗体溶液混匀,避光放置20 min,加入1 ml溶血素,混匀避光放置10 min,以1500 r/min转速下离心5 min,取其下层沉淀物加入200 μl破膜剂,避光在4 ℃下放置20 min,使用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后,离心保留下层沉淀物,加入IFN-γ-FITC、IL-4-PE各5 μl,避光在4 ℃下放置30 min,以固定剂固定后,在流式细胞仪中检测Th1、Th2水平。②Th17:将2组患者血液样本加入PBS混匀,加入分离试剂分离单个核细胞,使用培养基溶液重悬细胞,将其转移至24孔板中,分别加入丙二醇甲醚醋酸酯、蛋白质转运抑制剂、ionomycin溶液,调整其浓度,在37 ℃、5% CO2环境下放置4 h后,将其转移至试管中,并分别加入流式标记抗体溶液,对照管中加入等量同型抗体,避光在4 ℃下放置30 min,再次加入100 μl PBS溶液,加入1 ml固定剂,避光在4 ℃下放置30 min,加入2 ml破膜剂后离心,保留下层沉淀物,试验管中加入流式标记抗体溶液,普通组中加入等量同型抗体,避光在4 ℃下放置30 min,洗涤后再次加入0.5 ml PBS溶液,使用流式细胞仪检测Th17水平。③Treg:测试管中血液样品加入流式标记抗体溶液,避光在4 ℃下放置30 min,加入PBS溶液,加入1 ml固定剂,避光在4 ℃下放置30 min,使用2 ml破膜剂洗涤2次,使用正常大鼠血清封闭15 min,测试管加入流式标记抗体溶液,对照管加入等量抗体溶液,避光在4 ℃下放置30 min,再次以0.5 ml PBS洗涤,使用流式细胞仪检测Treg水平。

细胞因子水平检测:分别在输血前、输血后14 d时采集2组患者血样,离心取血清使用酶联免疫试剂盒检测其中白介素-2(IL-2)、白介素-10(IL-10)、白介素-17(IL-17)、干扰素(IFN-γ)。

1.4 观察指标

比较输血前和输血后14 d时,2组患者外周血CD4+T细胞亚群水平(Th1、Th2、Th17、Treg)、细胞因子水平(IL-2、IL-10、IL-17、IFN-γ)。比较输血后3个月内2组患者感染发生率。输血后随访3年,比较2组患者无进展生存期(PFS)。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 外周血CD4+T细胞亚群水平比较

输血前2组患者Th1、Th2、Th17、Treg水平比较无明显差异。输血后14 d时,辐照组患者Th1、Th17、Treg水平略高于输血前,Th2水平略低于输血前,差异无统计学意义(P>0.05);普通组患者Th1水平显著低于输血前,Th2、Treg水平显著高于输血前(P<0.05),Th17水平略高于输血前,但比较差异无统计学意义(P>0.05);辐照组Th1水平显著高于普通组,Th2、Treg水平显著低于普通组(P<0.05),2组Th17比较差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 2组患者外周血CD4+T细胞亚群水平比较

2.2 细胞因子水平比较

输血前2组患者IL-2、IL-10、IL-17、IFN-γ水平比较无明显差异。输血后14 d时,辐照组患者IL-10、IL-17水平略高于输血前,IL-2、IFN-γ水平略低于输血前,差异无统计学意义(P>0.05);普通组患者IL-2、IFN-γ水平显著低于输血前,IL-10、IL-17水平显著高于输血前(P<0.05);辐照组患者IL-2、IFN-γ水平显著高于普通组,IL-10、IL-17水平显著低于普通组(P<0.05),见表2。

2.3 感染发生率比较

输血后3个月内,辐照组感染发生率为3.08%(2/65),普通组感染发生率为8.57%(3/35),辐照组感染发生率低于普通组,差异无统计学意义(χ2=0.521,P=0.471)。

2.4 PFS比较

辐照组平均PFS为34.14个月(95%CI=31.266～35.477),普通组平均PFS为33.37个月(95%CI=32.878～34.862),2组PFS比较无统计学意义(Log Rank χ2=0.479,P=0.489),见图1。

图1 2组患者PFS比较

3 讨论

肝癌患者围术期由于贫血、血容量不足等原因,常使用异体输血辅助治疗,但异体输血中部分活性因子会影响患者免疫功能,导致输血后患者感染风险增加,不利于其回复,因此需研究适当方式缓解异体输血对患者免疫功能的影响[6]。

CD4+T细胞亚群是免疫过程中重要成员,在抗感染、抗肿瘤中起到重要作用。其中Th1具有激活抗肿瘤活性等作用,介导细胞免疫;Th2主要分泌免疫因子,参与体液免疫;Th17细胞可分泌白细胞介素-21(IL-21)等因子,参与感染、肿瘤等疾病过程;Treg可分泌IL-10等因子,参与肿瘤免疫过程,Th1、Th2、Th17、Treg水平可反映肝癌患者免疫能力[7]。异体普通悬浮红细胞输注时,其中存在的部分可溶性白细胞抗原等活性物质会引起肝癌患者机体免疫功能抑制。本次研究结果中,输血后14 d时,辐照组患者Th1、Th17、Treg水平略高于输血前,Th2水平略低于输血前,比较差异无统计学意义;普通组患者Th1水平显著低于输血前,Th2、Treg水平显著高于输血前,Th17水平略高于输血前,但比较差异无统计学意义;辐照组Th1水平显著高于普通组,Th2、Treg水平显著低于普通组,2组Th17比较差异无统计学意义,提示辐照红细胞输注可明显缓解异体输血所致的免疫抑制。原因在于,辐照红细胞使用定量射线照射血液,利用淋巴细胞对电离辐射敏感的特点,以特殊射线直接照射损伤细胞核,导致血液中T淋巴细胞活性丧失,并无法增殖分化,经异体输血输注至肝癌患者体内后,无法攻击患者自身免疫系统,可保持肝癌患者体内CD4+T细胞亚群动态平衡,维持其正常免疫应答[8]。

IL-2、IL-10、IL-17、IFN-γ均为免疫因子,由CD4+T细胞亚群分泌。普通红细胞输注治疗肝癌患者会抑制其免疫功能,从而影响其免疫因子分泌水平,提高感染风险[9]。本次研究结果中,输血前2组患者IL-2、IL-10、IL-17、IFN-γ水平比较无明显差异,输血后14d时,辐照组患者IL-10、IL-17水平略高于输血前,IL-2、IFN-γ水平略低于输血前,比较差异无统计学意义;普通组患者IL-2、IFN-γ水平显著低于输血前,IL-10、IL-17水平显著高于输血前;辐照组患者IL-2、IFN-γ水平显著高于普通组,IL-10、IL-17水平显著低于普通组;辐照组患者感染发生率低于普通组,比较差异无统计学意义;2组PFS比较无统计学意义,说明辐照红细胞输注可避免普通红细胞输注对肝癌患者免疫因子水平和感染风险的影响,辐照红细胞、普通红细胞输注对肝癌患者PFS均无明显影响。原因在于,普通红细胞经射线辐照后免疫因子等物质均失去活性,肝癌患者输注辐照红细胞后,其自身免疫功能受到异体输血的影响较小,CD4+T细胞亚群仍可维持一定范围内的动态稳定,分泌免疫因子可维持动态稳定,因此对IL-2、IL-10、IL-17、IFN-γ水平无明显影响[10]。辐照红细胞输注可减少异体输血对肝癌患者免疫功能的影响,患者输血后预后情况理想,对PFS无明显影响,而普通红细胞输注在输血后短期内抑制肝癌患者免疫功能,患者输血后短期内感染风险随之提高,本次研究结果中2组患者感染发生率比较无明显差异可能与病例数较少有关。而患者自身机体恢复能力可帮助其陆续恢复免疫功能,因此对于其PFS也无明显影响[11]。

综上所述,辐照红细胞输注对肝癌患者CD4+T细胞亚群水平、细胞因子水平、输血后感染风险的影响显著低于普通红细胞输注,且对肝癌患者PFS无明显影响,可作为临床异体输血处理参考方案之一。