化橘红黄酮类化合物对黄嘌呤氧化酶抑制活性研究

＊何勤勤 邓诗婷 林欢 杨泽林 何玉冰 韩寒冰 黄新敏

（广东石油化工学院 生物与食品工程学院 广东 525000）

化橘红是我国著名的南药，由芸香科植物化州柚（Citrus grandis cv.‘Tomentosa’）加工而成，化橘红中主要的活性成分是挥发油、黄酮类物质及多糖[1-2]。柚皮苷和野漆树苷是化橘红中含量最高的黄酮类物质[3]，具有祛痰、镇咳、抑制哮喘、降血压、降心率和抗氧化等效用[4-5]。近年来，随着人类生活水平提高，不良饮食、作息习惯等造成的高尿酸血症患病率逐年上升，已经成为人类第二大代谢性疾病[5-6]。黄嘌呤氧化酶是体内催化黄嘌呤或次黄嘌呤转化为尿酸的关键酶，通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性，可降低尿酸的形成[7]。在对黄酮类化合物活性的分析中发现，具有黄酮骨架的化合物可抑制黄嘌呤氧化酶活性[8]。李梦荣等[5]研究表明车前草内黄酮化合物异泽兰黄素通过氢键、范德华力、π-σ键和疏水作用力等与黄嘌呤氧化酶结合进而抑制酶活性。基于此，本文采用乙醇提取化橘红果实及花中黄酮类化合物并进行体外黄嘌呤氧化酶抑制效果研究，同时分析不同化橘红果、花代用茶浸泡方式浸出液对黄嘌呤氧化酶的抑制效果，以期为化橘红在治疗高尿酸血症和痛风中的应用提供指导。

1.材料与方法

(1)实验材料

化橘红果实（果龄60d）及花（花瓣刚展开）采自橘品天下科技发展（化州）有限公司基地，采摘后运回实验室，烘干后粉碎过40目筛得到小粉末用于提取。化橘红果实及花代用茶制备参照传统方法，将果实烘干后切成厚度3mm的薄片为果实代用茶，花烘干后为花代用茶。黄嘌呤氧化酶、黄嘌呤等购于上海源叶生物科技有限公司。柚皮苷、野漆树苷、柚皮素、芹菜素等标准品购于ChemFaces公司。其他分析纯试剂等购于天津市大茂化学试剂厂。

(2)仪器

万分之一电子天平（AR224CN，奥豪斯仪器有限公司）、数控超声波清洗器（PS-60A，江苏省昆仑山市超声仪器有限公司）、光吸收全波长酶标仪（ReadMax 1200，上海闪谱生物科技有限公司）、高效液相色谱（LC-20A，株式会社岛津制作所）。

(3)化橘红黄酮类化合物提取

化橘红果实、花黄酮类化合物提取参照韩寒冰等[3]方法进行优化，以60%乙醇作为提取溶剂，在30℃下采用300W超声辅助提取2h，提取完成后7500r/min离心10min，上清液即为化橘红黄酮类化合物提取液。上清液以韩寒冰等[3]建立的方法采用高效液相色谱检测四种主要成分柚皮苷、野漆树苷、柚皮素、芹菜素的含量，并以总和代表总黄酮含量。随后将提取液稀释为50μg/mL、100μg/mL和150μg/mL用于分析黄嘌呤氧化酶抑制活性。

(4)化橘红果实和花代用茶浸液制备

结合化橘红代用茶使用习惯，取0.5g化橘红果实或者花，按照不同料液比加入温度90℃的水，浸泡10min后过滤，收集过滤液，其中果实料液比为1:100、1:200、1:300、1:400、1:500，花料液比为1:50、1:100、1:150、1:200、1:250。取0.5g化橘红果实或者花，果实按照1:300料液比，花按照1:150料液比加入60℃、70℃、80℃、90℃、100℃的水，浸泡10min后过滤，收集过滤液。取0.5g化橘红果实或者花，果实按照1:300料液比，花按照1:150料液比加入90℃的水，浸泡5min、10min、15min、20min、25min，过滤收集过滤液，滤液用于分析不同时间浸提液对黄嘌呤氧化酶抑制活性。根据单因素结果，采用正交实验法进行不同料液比、不同水温度、不同浸泡时间化橘红果实和花代用茶浸提（表1）。正交实验表如表1，分别取0.5g化橘红果实和花，按照正交试验表进行浸泡和过滤，滤液用于检测黄嘌呤氧化酶抑制活性。

表1 正交实验法浸提化橘红果实因素水平表

(5)黄嘌呤氧化酶抑制效果分析

黄嘌呤氧化酶抑制效果检测方法参照王亚楠等[10]方法。使用酶标仪在295nm波长下检测吸光度。根据一定时间内测定的吸光度计算酶活力。加入化橘红提取物的酶活力表示为U1；加入0.01mL磷酸缓冲液作为阳性对照组的酶活力表示为U2，酶相对抑制率=（1-U1/U2）×100%。

(6)数据统计与分析

所有实验均3个生物学重复，结果以平均值±标准差表示，采用SigmaPlot 11进行数据分析及制图。

2.结果与分析

(1)化橘红果实和花提取液中黄酮类物质含量

化橘红果实中总黄酮4095.07μg/mL，其中柚皮苷4016.67μg/mL，野漆树苷48.39μg/mL，柚皮素25.33μg/mL，芹菜素4.68μg/mL（表2）。花中的总黄酮为673.76μg/mL，其中柚皮苷626.18μg/mL，野漆树苷36.53μg/mL，柚皮素3.88μg/mL，芹菜素7.17μg/mL（表2）。

表2 化橘红果实和花提取液中黄酮类物质含量

(2)化橘红果实和花黄酮类化合物提取液对黄嘌呤氧化酶抑制效果

酶活性抑制结果显示化橘红果实和花的黄酮类化合物提取液对黄嘌呤氧化酶活性的抑制效果随浓度上升而加强。其中150μg/mL的果实提取液抑制效果为53.13%，而150μg/mL的花提取液抑制效果为49.47%（图1）。

图1 化橘红黄酮类化合物提取液对黄嘌呤氧化酶抑制效果

(3)不同因素对化橘红果实和花代用茶浸液黄嘌呤氧化酶抑制效果的影响

化橘红果实和花浸提液黄嘌呤氧化酶抑制率随着料液比的升高而呈现下降趋势（图2A，B）。随着浸提水温上升，浸提液酶抑制率呈现上升趋势，水温100℃时，果实和花酶抑制率分别为54.3%和47.7%（图2C）。随着浸泡时间延长，浸提液酶抑制率呈现上升趋势，浸泡时间在15min之后，抑制率上升缓慢（图2D）。结合代用茶引用习惯，化橘红果实正交试验因素水平选择料液比1:200、1:300、1:400，料液比1:100、1:150、1:200，温度80℃、90℃、100℃，浸泡时间5min、10min、15min。

图2 单因素对化橘红果实及花浸提液黄嘌呤氧化酶活性影响

正交实验法影响果实和花浸出液酶抑制效果的因素依次为料液比＞浸泡时间＞温度，其中果实浸出液最佳条件是料液比1:200、水温100℃、浸泡时间15min，花浸出液最佳条件是料液比1:100、水温100℃、浸泡时间15min（表3）。在优化方案下化橘红果实浸提液酶抑制率为55.1%，花浸提液酶抑制率为51.1%，该结果与正交实验相符合（表3）。

表3 正交实验设计与结果

3.讨论

本研究结果显示化橘红果实及花乙醇提取物中均含有柚皮苷、野漆树苷、柚皮素和芹菜素4种黄酮类物质，这与其他研究结果一致[2-3]。化橘红果实和花的黄酮类化合物提取液均能抑制黄嘌呤氧化酶活性，150μg/mL的果实提取液抑制效果为53.13%，150μg/mL的花提取液抑制效果为49.47%，有研究结果表明柚皮苷可能通过三个传统氢键与黄嘌呤氧化酶结合进而起到抑制作用[11]。正交实验结果显示果实料液比1:200，花料液比1:100，在水温100℃浸泡15min，该条件下获得的化橘红果实及花浸出液达到最高的黄嘌呤氧化酶抑制效果，验证试验结果表明抑制效果分别为55.1%和51.1%。随着我国中医药科技的发展与复兴，临床用中药来控制痛风取得积极的成果，本研究结果显示化橘红果实和花提取液及代用茶浸提液均对黄嘌呤氧化酶有抑制效果，可进一步进行应用开发研究，为化橘红用于预防和治疗高尿酸血症提供参考依据。