基于Top-down技术评定液相色谱法测定棉籽油中游离棉酚的不确定度

孙晓晗 李烁

作者简介：孙晓晗（1991—），女，山东潍坊人，硕士，工程师。研究方向：检验检测质量控制。

摘 要：目的：利用Top-down技术评定液相色谱法测定棉籽油中游离棉酚的不确定度。方法：按照《食品安全国家标准 植物性食品中游离棉酚的测定》（GB 5009.148—2014）规定的分析方法，在期间精密度条件下，对棉籽油质控样品中游离棉酚的含量进行测定，基于Top-down法的原理对检测数据进行分析。结果：在证明分析结果呈正态性、独立性且偏倚受控的情况下，不确定度为1.56 mg·kg-1。结论：Top-down技术将不确定度评定与实验室内部质量控制工作有机结合起来，客观地监测实验室的期间精密度水平，在化学分析领域具有很强的可操作性。

关键词：游离棉酚；不确定度；液相色谱法

Evaluation of Uncertainty of Determination of Free Gossypol in Cottonseed Oil by Liquid Chromatography Based on Top-Down Technique

SUN Xiaohan， LI Shuo

（Jinan Inspection and Testing Center for Food and Drug Control， Jinan 250102， China）

Abstract： Objective： To evaluate the uncertainty of determination of free gossypol in cottonseed oil by liquid chromatography with Top-down technique. Method： According to the analysis method specified in GB 5009.148—2014， the content of free gossyol in the quality control sample of cottonseed oil was determined under the condition of period precision， and the detection data was analyzed based on the principle of Top-down method. Result： An uncertainty of 1.56 mg·kg-1 was assessed with normality， independence， and controlled bias demonstrated. Conclusion： The Top-down technique combines the uncertainty assessment with the internal quality control of the laboratory， objectively monitors the period precision level of the laboratory， and has strong operability in the field of chemical analysis.

Keywords： free gossypol; uncertainty; liquid chromatography

游離棉酚是有活性醛基和活性羟基的萘醛类化合物，其生物毒性较大，人们食用含有过量棉酚的食物后会损伤心、肝、肾等器官，甚至导致不育[1]。不确定度评定可以帮助评估测量结果的可靠性和准确性，是一项重要的质量控制手段[2]。国内常用的不确定度评定方法有Bottom-up法（又称GUM法）。其是通过不确定度传播规律和概率分布规律确定输出量，最终确定扩展不确定度[3-4]。近年来Top-down评定技术（又称Globe法）[5]逐渐兴起，该评定方法运用统计学原理对受控结果进行评定，弥补了GUM法不能很好适配复杂化学分析实验的不足，被广泛应用于食品检测、环境监测等多个领域[6-7]。本文结合食品检测实验室液相色谱法测定棉籽油中游离棉酚的质控数据，根据Top-down技术在数据受控的情况下评定棉籽油中游离棉酚的不确定度。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器设备

食用棉籽油，市售。

丙酮；磷酸；无水乙醇；抗坏血酸（维生素C）；甲醇；棉酚标准品（纯度＞95%）；棉籽油质控样品（棉酚质量浓度为50 mg·kg-1，国家药品标准物质）。

美国沃特世公司液相色谱联用仪（2695型，带紫外检测器）；涡旋振荡器；天平（感量为0.01 g和

0.000 01 g）；2 mL、15 mL离心管；离心机（转速≥10 000 r·min-1）；一次性有机相微孔滤头（带0.22 μm微孔滤膜）。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理

根据《食品安全国家标准 植物性食品中游离棉酚的测定》（GB 5009.148—2014）[8]，称取1 g（精确至0.01 g）棉籽油质控样品（质量浓度为50 mg·kg-1）于15 mL离心管中，加入5 mL用抗坏血酸饱和的无水乙醇（0.1%维生素C，现用现配），涡旋5 min，冷藏静置分层（1 h以上），取上清液于2 mL离心管，14 000 r·min-1离心5 min，上清液过0.22 μm微孔滤膜，收集滤液于进样瓶中以备进样。以不含游离棉酚的棉籽油为阴性样品，按同一操作方法进行空白试验。

1.2.2 仪器工作条件及测定

色谱柱：RP-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇∶磷酸溶液（0.2%）=85∶15；流速：

1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃±1 ℃；测定波长：235 nm；

1.2.3 标准工作液的配制及标准曲线的绘制

标准工作液的配制及标准曲线的绘制完全按照《食品安全国家标准 植物性食品中游离棉酚的测定》（GB 5009.148—2014）[8]操作。

2 结果与分析

2.1 游离棉酚质控样品测定结果

在期间精密度测量条件下对游离棉酚理论质量浓度为50 mg·kg-1的棉籽油质控样品（QCS）进行定期检测，得到30组数据。根据Grubbs检验法，按式（1）对测得的数据进行离群值检验。

（1）

式中：G为Grubbs统计量；x可疑为数据中的可疑离群值，mg·kg-1，包括30组数据中的最大值（xmax）和最小值（xmin）；x为30组数据的平均值，mg·kg-1；s为标准偏差，mg·kg-1。

由表1得xmax=49.8 mg·kg-1，xmin=47.2 mg·kg-1，x=48.72 mg·kg-1，s=0.69 mg·kg-1，則Gmax=1.565，Gmin=2.203。查阅Grubbs临界表，G（0.05，30）=2.745，Gmax和Gmin均低于G（0.05，30），表明在95%的置信概率下30组数据无离群值。

2.2 游离棉酚质控样品数据的正态性和独立性检验

将30组数据按照值升序排列，根据下列公式分别计算wi和wi（MRi）：

（2）

（3）

（4）

（5）

式中：xi为第i次检测结果，mg·kg-1；x为30组数据的平均值，mg·kg-1；s为标准偏差，mg·kg-1；wi为标准偏差情况下的标准化值；MRi为移动极差，mg·kg-1；为移动极差的平均值，mg·kg-1；sR为期间精密度标准差，mg·kg-1；wi（MRi）为期间精密度标准差情况下的标准化值。经计算，=

0.876 mg·kg-1，sR=0.78 mg·kg-1，MRi、wi和wi（MRi）的计算结果见表1。

正态统计量A2和正态统计量的修正值A2*的计算公式为

（6）

（7）

（8）

式中：Ai为第i次检测结果的正态统计量；pi为正态概率值，根据wi（或wi（MRi））查阅得到，具体数值见表1中pi（s）或pi（MRi）；n为测定次数（n=30），A2和A2*分别为正态统计量和正态统计量修正值；当将wi转换为pi值即pi（s）值代入上式计算时，得到的正态统计量及其修正值分别表示为As2和As2*，以评估数据的正态性；当将wi（MRi）转换为pi值即pi（MRi）值代入上式计算时，得到的正态统计量及其修正值分别表示为AMR2和AMR2*，以评估数据的独立性。经计算，As2=0.291 7，As2*=0.299 7；AMR2=0.320 4，AMR2*=

0.329 2。As2*和AMR2*值均小于0.752，表明在95%概率下，该组检测数据既具有正态性又具有独立性。

2.3 系统误差的检验

本文采用游离棉酚质控样品的理论质量浓度50 mg·kg-1，实测质量浓度为48.72 mg·kg-1，偏倚b=48.72-50=-1.28 mg·kg-1，重复测量标准偏差（s）为0.69 mg·kg-1，根据《检测实验室中常用不确定度评定方法与表示》（GB/T 27411—2012）的要求，偏倚|b|＜2s，表明检测数据偏倚受控，但接近临界值需要注意监测。

2.4 不确定度评定

通过以上检验，验证了30组数据是在偏倚受控的期间精密度测量条件下测得的，此时在95%概率下，棉籽油质控样中游离棉酚含量的不确定度U=2sR=2×0.78=1.56 mg·kg-1，即棉籽油质控样中游离棉酚含量的测定结果为（48.72±1.56） mg·kg-1（k=2）。

3 结论

在期间精密度测量条件下，利用Top-down技术评定液相色谱法测定棉籽油中游离棉酚的不确定度，既能避免复杂不确定度分量的计算，又能充分利用实验室积累的质控数据，客观地监测实验室的期间精密度水平，促使实验室在结合本单位整体质控方案的基础上将测量不确定度工作落到实处。

参考文献

[1]CORINNA K，HANNA M，HEIDEL F，et al.Gossypol toxicity and detoxification in Helicoverpa armigera and Heliothis virescens[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology，2016，78：69-77.

[2]中国合格评定国家认可委员会.化学分析中不确定度的评估指南：CNAS-GL06：2006 [EB/OL].（2006-06-01）[2023-10-08].https：//www.renrendoc.com/paper/

194247304.html.

[3]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.测量不确定度评定与表示：JJF 1059.1—2012[S].北京：中国标准出版社，2012．

[4]袁河，肖晓义，刘佳，等.高效液相色谱法测定食用槟榔中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的不确定度评定[J].食品与机械，2020，36（8）：77-81.

[5]国家认证认可监督管理委员会.化学检测领域测量不确定度评定 利用质量控制和方法确认数据评定不确定度：RB/T 141—2018[S].北京：中国标准出版社，2018.

[6]何伟彪，罗美.利用top-down技术评定ICP-MS法测定水中镉的测量不确定度[J].中国环境监测，2015，31（1）：118-121.

[7]闫顺华，佟瑞敏，古丽努尔·沙马力.Top-down精密度法评定大葱中镉含量测定的不确定度[J].分析仪器，2021（6）：100-104.

[8]国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 植物性食品中游离棉酚的测定：GB 5009.148—2014[S].北京：中国标准出版社，2014.