福建省部分地区奶牛新孢子虫病血清学抗体检测

张务平

福建农林大学动物科学学院（蜂学学院），福建福州 350002

0 引言

专一性细胞内寄生的新孢子虫可引起牛、羊、猪和鸟类等多种动物发生新孢子虫病，犬、狼、狐狸等犬科动物是其终末宿主。新孢子虫病对牛的危害很严重，主要导致母牛怀孕期流产、产死胎以及新生犊牛的运动神经失调等，对全世界的养牛业造成巨大的经济损失[1，2]。该病呈全世界分布，传播方式主要包括水平传播和垂直传播两种，动物一年四季都可感染。基于新孢子虫速殖子全虫灭活研制的疫苗——Bovilis-Neoguard是默克公司生产的目前用于预防奶牛流产的全球唯一商品化疫苗，但因保质期短、生产成本高、不能切断垂直传播等缺点，未被广泛推广使用。磺胺类药物对动物新孢子虫感染急性期的虫体有一定的治疗效果，但对寄生在组织器官中的包囊没有效果，并且该类药物具有较大的副作用，临床使用该类药物治疗新孢子虫病有一定的局限性。因此，目前尚未有有效的药物和疫苗来治疗和预防动物新孢子虫病。通过定期的、分群体的对养殖场内奶牛进行血清学监测，可以准确掌握奶牛群体的新孢子虫感染情况，从而制定和采取相应的新孢子虫病防控措施。新孢子虫抗体检测可以通过酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接荧光抗体试验（IFAT）、核酸检测（NAT）等多种血清学方法来完成，其中ELISA是应用最广泛的血清学检测方法[3]。本研究主要是为了解福建省奶牛新孢子虫病的流行情况，以期为福建省规模化奶牛场防控新孢子虫病提供一定的理论支持，从而降低新孢子虫病对畜牧业造成的危害。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 血清样品

2021年6月至2022年12月，从福建省漳州市、南平市、三明市和龙岩市4 个地区的规模化奶牛场，通过颈静脉采集健康奶牛全血1 472 份，其中漳州395份，南平410 份，三明351 份，龙岩316 份，详细记录样品信息，包括地区、年龄、胎次、奶牛场场内或周边是否存在饲养犬只或流浪犬只等。采集的样品低温运送至实验室，使用离心机3 000 r/min离心，分离收集血清，然后置于-20 ℃冰箱保存待检。

1.1.2 主要试剂

ID Screen® Neospora caninum Indirect ELISA抗体检测试剂盒，购自爱德士生物科技有限公司，置于4 ℃冰箱冷藏保存备用，使用前从冰箱取出恢复至室温后，试剂盒均在有效期内使用。

1.1.3 主要仪器

高速离心机（Sorvall Legend Micro 17）和全波长扫描式多功能读数仪（VARIOSKAN FLASH），均购自赛默飞世尔科技公司（ThermoFisher Scientific）；电热恒温培养箱（DHP-9032），购自上海申贤恒温设备厂，单道（ACURA 825 autoclavable）和8道（ACURA 855 autoclavable）可调节移液器，均购自普迈瑞士索科（SOCOREX）公司。

1.2 检测方法

对采集的所有奶牛血清样品检测新孢子虫抗体，均严格按照试剂盒说明书步骤操作，根据临界值判定结果。每次试验均设有阴、阳性对照，若有可疑孔，则进行复检。

1.3 统计学分析

应用 SPSS 22.0软件，对不同地区、不同年龄阶段和不同胎次奶牛的新孢子虫抗体检测阳性率情况进行统计学方差分析。

2 结果

2.1 福建省不同地区的检测结果

本研究采用ELISA方法，对采自福建省漳州、南平、三明、龙岩4 个地区的规模化奶牛场1 472份血清样品进行新孢子虫抗体血清学检测。根据临界值对样品检测数据进行阴、阳性判定。结果表明：共110 份样品呈新孢子虫抗体阳性，总阳性率为7.47%；漳州、南平、三明、龙岩4 个地区奶牛场的新孢子虫抗体阳性率分别为5.57%、5.12%、7.41%和12.97%，其中龙岩地区奶牛的新孢子虫病流行较严重。经统计学分析，福建省不同地区奶牛新孢子虫抗体阳性率差异不显著（P＞0.05），见表1。

表1 福建省不同地区奶牛新孢子虫抗体检测结果

2.2 不同年龄阶段的检测结果

不同年龄阶段的奶牛血清样品均检测到新孢子虫抗体阳性，阳性率范围为2.93%～9.56%。其中1～3 岁奶牛血清样品的新孢子虫抗体阳性率最高，为9.56%；其次是3～5 岁奶牛血清样品的阳性率，为8.56%；大于5 岁的阳性率最低，为2.93%（表2）。经统计学分析，不同年龄阶段奶牛血清样品的新孢子虫抗体阳性率差异显著（P＜0.05）。

表2 不同年龄阶段奶牛血清样品新孢子虫抗体检测结果

2.3 不同胎次的检测结果

奶牛按照不同生产胎次分组，新孢子虫抗体阳性率最高的血清样品来自≥3 胎次的奶牛，为9.50%；未产胎的奶牛血清样品新孢子虫抗体阳性率为8.42%，新孢子虫抗体阳性率最低的血清样品来自1 胎次的奶牛，为4.83%（表3）。经统计学分析，不同胎次奶牛血清样品的新孢子虫抗体阳性率差异不显著（P＞0.05）。

表3 不同胎次奶牛新孢子虫抗体检测结果

3 结论与讨论

新孢子虫病对牛的危害严重，给全球畜牧业造成巨大的经济损失。据估计，全球每年因新孢子虫病给养牛业造成的经济损失为12.89 亿美元，最高可达到23.80 亿美元[4]。新孢子虫病广泛流行于世界各地，目前新西兰、澳大利亚、美国、希腊、巴西和日本等50 多个国家均报道有新孢子虫病的发生[4]。我国于2003年在北京由中国农业大学动物医学院刘群教授团队首次发现新孢子虫病，随后在新疆、内蒙古、甘肃、青海、河北、河南和吉林等多个省份均报道新孢子虫病例[5～10]。2022年，Ying等对国内外重要期刊发表的51 篇关于中国牛新孢子虫的相关研究数据和结果进行综合分析，发现总计33 945 头牛检测新孢子虫的感染率平均为13.69%[11]。

本研究结果显示，福建省奶牛血清样品新孢子虫抗体总阳性率为7.4 7%，低于我国广西（50.9%）、山西（13.60%）、河南（41.2%）、河北（37.34%）、青藏高原（18.6%）等省份或地区的感染率[12～16]，在不同地区或者同一地区的不同奶牛场新孢子虫感染率差异很大。造成这种差别的原因可能由于不同区域之间的饲养条件（放牧或舍饲）、奶牛场的基地建设和环境卫生状况、生物安全和奶牛场场内或者周边是否有犬只等情况存在差异，并且各个研究采用不同检测方法的敏感性等，都会影响奶牛新孢子虫的感染率统计结果。

本研究结果表明，1～3 岁的奶牛血清样品新孢子虫抗体阳性率最高为9.56%，＞5岁的奶牛血清样品阳性率最低（2.93%）；≥3 胎次的的奶牛血清样品新孢子虫抗体阳性率最高（9.50%），产胎1 次的奶牛血清样品新孢子虫抗体阳性率最低（4.83%）。经统计学分析，不同年龄阶段奶牛血清样品新孢子虫抗体阳性率差异显著（P＜0.05），表明年龄因素对牛新孢子虫易感有显著影响。

感染犬排出新孢子虫卵囊，一旦污染了食物或水，被不慎食入则是包括奶牛在内的中间宿主通过水平传播的重要感染途径。因此，本研究在采集样品过程中，专门对奶牛场场内及周边是否有饲养犬或流浪犬的问题进行了询问，所有奶牛场场内均未饲养犬只，这可能是福建省奶牛新孢子虫感染率低的主要原因之一。有研究显示，鸟类也可以感染新孢子虫，福建省奶牛场周边鸟类较多，因此养殖场应加装防鸟网。垂直传播被认为是牛群中尤其是妊娠母牛最主要的传播途径，但有研究认为公牛感染新孢子虫后，可以影响其精子质量，包括精液浓度和运动活力下降，因此牛场也应对公牛定期进行新孢子虫的检测。

综上所述，福建省不同地区的规模化奶牛场普遍存在新孢子虫感染，牛场应建立健全该病的检疫隔离制度，采取综合防控策略，制定有效的管理措施，才能较好控制奶牛新孢子虫病。