奶牛子宫内膜炎乳房链球菌耐药性与毒力基因检测分析

刘志强

香河县农业农村局，河北廊坊 065400

0 引言

子宫内膜炎是奶牛常见产科疾病，不仅损害机体健康，还会引起不孕、泌乳量下降、产犊间隔延长、淘汰率增加和养殖经济损失[1]。该病的致病因素复杂，但细菌感染是引起奶牛子宫内膜炎的主要原因，包括葡萄球菌、大肠埃希菌、链球菌等数十种病原菌[2]。乳房链球菌（Streptococcus uberis，S.uberis）是具有溶血能力的革兰氏阳性球菌，直径小于2.0 μm，兼性厌氧，营养要求高[3]，是圈舍饲养环境普遍存在的细菌[4]，可致奶牛感染乳房炎、子宫内膜炎等疾病。细菌的致病机制与毒力因子密切相关，S. uberis菌株携带与其致病力和持续感染相关的毒力因子，如透明质酸荚膜的编码基因hasA、hasB、hasC，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）编码基因gapC及黏附相关基因等，可在宿主中黏附定植，造成组织细胞损伤，逃避宿主免疫应答，持续破坏宿主免疫系统，引起宿主机体致病[5，6]。临床治疗奶牛子宫内膜炎中，抗生素发挥重要作用，但存在不合理使用造成细菌耐药性、牛奶抗生素残留超标等问题。对S.uberis耐药性监测有利于科学合理使用抗生素，提高药物治疗效果，降低细菌耐药性。本研究采集香河县部分奶牛场子宫内膜炎患牛的子宫黏液样本，对S.uberis进行分离鉴定、耐药性、毒力基因检测，了解分离菌株携带毒力基因致病机制、细菌耐药性，为有效防控奶牛子宫内膜炎提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料来源

2023年6月，选取香河县5 家奶牛场临床表现发情不规律、屡配不孕、子宫分泌棕褐色或红色脓性黏液的76 头空怀奶牛，每头采用输精枪进入子宫，通过兽用注射器吸取子宫黏液，装入采样管，1 份/头，共收集样本76 份，送实验室备检。

1.2 主要培养基、试剂和抗生素

血琼脂平板、CAMHB肉汤，购自广东环凯微生物科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；2×Taq Super Master Mix，DL2000 DNA Marker，购自天根生化科技（北京）有限公司；红霉素、氨苄西林等8 种抗生素，购自杭州微生物试剂有限公司；细菌16S rRNA通用引物及hasA、hasB、hasC等10 种毒力基因特异性引物，由北京擎科生物技术有限公司合成，引物生物信息见表1。

表1 11 种基因PCR 引物生物信息

1.3 主要仪器

DNA凝胶成像系统、酶标仪、PCR扩增仪，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.4 乳房链球菌PCR 鉴定

将病料无菌接种于血琼脂平板，37 ℃培养24 h，挑取白色或灰白色、边缘整齐、表面光滑隆起、光泽鲜亮、细小的卵圆形菌落，再连续传代3 次接种于血琼脂平板，取纯培养菌落，按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取S. uberis的DNA，以此为模板，使用16S rRNA引物进行PCR扩增。

扩增体系为25 μL：2×Taq Super Master Mix 12.5 μL，浓度10 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL，DNA模板 2 μL，灭菌超纯水补至25 μL，同时以灭菌超纯水为阴性对照。

反应程序：95 ℃预变性5 min；93 ℃变性25 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s，共运行30 个循环；72 ℃终延伸8 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定为阳性后送北京擎科生物技术有限公司进行核酸测序，并在NCBI数据库中利用Blast程序与收录的参考菌株乳房链球菌（登录号：JF896457.1）比对，确定分离菌株的属和种。

1.5 乳房链球菌耐药性检测

根据美国临床实验室标准委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）（2017版）发布的《需氧菌稀释法药敏试验指南》，采用微量肉汤稀释法测定氨苄西林、四环素、红霉素、左氧氟沙星、克林霉素、利福平、庆大霉素、头孢噻呋共8 种抗菌药对分离菌株乳房链球菌的最小抑菌浓度（M i n i m u m Inhibitory Concentration，MIC）。在96 孔板中加入100 μL抗菌药液，使用CAMHB肉汤对其进行2 倍梯度稀释，然后加入1 0 0 μ L 终浓度为1 × 105CFU/mL的菌悬液，37 ℃培养2 4 h。质控菌株为肺炎链球菌A T C C 4 9 6 1 9。观察每孔混合液变化，若96 孔板中肉汤培养基混浊，表明有细菌生长；若肉汤培养基完全清亮，表明无细菌生长[12]。以无细菌生长的抗菌药最小浓度作为该抗菌药对S. uberis的MIC。并参照CLSI发布的8 种抗菌药耐药临界值判断抗生素耐药性，见表2。

表2 8 种抗菌药的耐药临界值 单位：μg/mL

1.6 乳房链球菌毒力基因检测

按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书，提取S. uberis基因组DNA，以hasA、hasB、hasC、slp、sua、gapC、pauA、fpb、acdA、cfu为特异性引物，用PCR检测S. uberis毒力基因携带情况。PCR扩增体系和反应条件同1.4（各引物退火温度见表1）。

2 结果

2.1 乳房链球菌分离鉴定

76 份样本经过细菌分离培养，有18 份产生的菌落特征符合乳房链球菌，进一步采用PCR分子鉴定。这18 株分离菌经与NCBI数据库收录的参考菌株同源性比对，均达到96.6%以上，为S. uberis。总分离率23.68%，5 家养殖场18 株S.uberis分离情况见表3。

表3 18 株乳房链球菌分离情况

2.2 乳房链球菌耐药性检测

采用CLSI推荐的微量肉汤稀释法进行18 株S.uberis对8 种抗生素的耐药性检测。结果发现（表4），其耐药率为16.67%～88.89%。9 株对红霉素耐药，MIC值为0.063～2 μg/mL；6 株对左氧氟沙星耐药，MIC值为0.031～32 μg/mL；12 株对克林霉素耐药，MIC值为0.125～4 μg/mL；16 株对庆大霉素耐药，MIC值为0.25～32 μg/mL；13 株对四环素耐药，MIC值为0.125～16 μg/mL；10 株对氨苄西林耐药，MIC值为0.063～32 μg/mL；3 株对头孢噻呋耐药，MIC值为0.125～4 μg/mL；10 株对利福平耐药，MIC值为0.125～16 μg/mL。

表4 乳房链球菌耐药性检测结果 单位： %

2.3 乳房链球菌毒力基因检测

用PCR对18 株乳房链球菌的10 种毒力基因进行检测（表5），结果显示，有9 种毒力基因被检出，但未检出hasC。所有菌株均检出slp、sua、gapC、fpb、cfu、pauA，而hasA、hasB、acdA检出率分别为38.89%（7/18）、50.00%（9/18）、33.33%（6/18）。共有5 种类型毒力基因组合，其中slp＋sua＋cfu＋gapC＋fpb＋pauA＋acdA和slp＋sua＋cfu＋gapC＋fpb＋pauA＋hasB占比较高，分别为27.78%和33.33%。

表5 9 种毒力基因组和类型

3 讨论

乳房链球菌为常见的环境性致病菌，是一种广泛存在于奶牛体内不同部位、垫料、土壤及奶牛群环境中的病原菌，对人和动物均能表现易感，但一般不引起发病，只在宿主免疫力下降或组织发生损伤时才出现明显的炎症反应。分娩母牛在产犊过程中子宫颈口处于张开状态，定植于生殖道内的正常菌群及环境性致病菌逆行进入子宫，大部分致病菌在21 d内通过奶牛子宫的自净作用被排出体外，而无法排出的致病菌可导致奶牛感染子宫内膜炎。大量研究证实，乳房链球菌是奶牛子宫内膜炎的主要致病菌之一。王孝武等[13]报道，甘肃某奶牛场子宫内膜炎病原菌的分离鉴定结果发现，乳房链球菌分离率为8.33%。凌丁等[14]对南宁市郊奶牛子宫内膜炎病原菌进行研究，发现乳房链球菌分离率为25.00%。李蕊等[15]对保定市奶牛子宫内膜炎的致病菌进行分离鉴定，乳房链球菌检出率为20.80%。本研究对76 份奶牛子宫内膜炎样本进行乳房链球菌分离鉴定，总分离率为23.68%。表明乳房链球菌已成为不同地区、不同奶牛场的奶牛子宫内膜炎常见致病菌。

细菌致病力与其携带毒力因子密切相关，研究毒力因子有助揭示致病机理，建立疫病诊断方法，筛选基因靶点研制疫苗。pauA基因编码纤溶酶原激活物，可将纤溶酶原激活为纤溶酶，水解宿主细胞外基质蛋白及上皮细胞紧密连接蛋白，促进细菌定植及扩散[4]，pauA能激活牛、羊和马纤溶酶原的纤溶酶原激活剂，但不能激活猪或人纤溶酶原[16]。透明质酸荚膜由hasA、hasB、hasC基因编码，因其在吞噬中发挥重要作用而成为主要毒力因子之一[17]。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）由gapC基因编码，是一种广泛存在于原核和真核生物表面的酶，参与糖酵解，将甘油醛-3-磷酸甘油转化为1，3-二磷酸甘油酸，被认为是毒力因子[18，19]。乳房链球菌黏附分子能结合乳铁蛋白，在乳房炎发病机制中起重要作用，由sua基因编码。cfu基因编码CAMP因子，可增强β-溶血型金黄色葡萄球菌的溶血活性。acdA基因编码Zn结合蛋白，slp基因编码表面脂蛋白，fpb基因编码一种经分选酶加工的表面蛋白[6]。本研究18株乳房链球菌均携带毒力基因slp、sua、cfu、gapC、fpb和pauA，表明这些毒力基因在致病过程中发挥主要作用，并且流行广泛，可作为研制疫苗的候选基因。hasA、hasB和acdA检出率较低，表明不是主要致病因子，其发病机理有待进一步研究。

长期以来，在奶牛子宫内膜炎的治疗中，抗菌药依然是常用药物，但不合理使用和耐药基因变化导致细菌耐药性问题日益严重。对细菌进行耐药性监测可为临床使用抗菌药提供参考，降低细菌耐药性和多种耐药谱扩大。本研究对8 种抗菌药的乳房链球菌MIC值进行检测，结果表明，乳房链球菌对庆大霉素、克林霉素、四环素耐药性较严重，分别达88.89%、66.67%、72.22%，仅对左氧氟沙星和头孢噻呋较敏感。Zhang等[20]报道，从我国西北地区临床型奶牛乳房炎病例分离的乳房链球菌对四环素（耐药率81.3%）和克林霉素（耐药率62.5%）高度耐药，而对氨苄西林（耐药率2.7%）敏感。赵祎云等[21]发现，兰州地区奶牛乳房炎乳房链球菌对氨苄西林、左氧氟沙星耐药。Garch等[22]2015—2016年对欧洲乳房炎调查，结果表明大部分乳房链球菌对氨苄西林敏感，24.0%、37.5%的菌株分别对红霉素、四环素耐药。上述结果表明细菌耐药性存在区域差异化，这与养殖场使用抗菌药习惯有关。

4 结论

本研究表明，香河县奶牛子宫内膜炎病例中乳房链球菌的分离率较高，携带多种已知毒力基因。该地区乳房链球菌对庆大霉素、克林霉素、四环素耐药性较高，对左氧氟沙星和头孢噻呋较敏感。