响应面法优化废弃龙眼壳中黄酮的提取研究

2024-01-14李鹤祥

韶关学院学报 2023年12期

叶芳，李鹤祥

（韶关学院化学与土木工程学院，广东韶关 512005）

龙眼又名桂圆，它开胃健脾，补虚益智，可药食兼用，是极好的滋补佳品［1-2］. 中国是龙眼的原产国及生产大国，种植面积和产量均居世界首位［2-3］. 我国每年在获得龙眼果肉及其加工产品过程中会产生大量废弃的龙眼壳，若能合理利用这些废弃的龙眼壳，不仅能够节约资源，保护环境，还能提高龙眼种植业的经济效益. 而龙眼壳中所富含的黄酮类化合物，具有抗氧化抗衰老［4-5］、抗肿瘤［6-7］、改善血液循环［8-9］、降低胆固醇［10］、镇痛［11］等作用.

影响龙眼壳黄酮提取率的因素较多，如提取的溶剂溶解度、温度、时间以及料液比等，只有通过大量试验探索才能得到提取的最佳条件. 为了减少试验次数，本研究采用了响应面法来得到龙眼壳中黄酮提取的最佳条件.

1 试验部分

1.1 主要试验材料与仪器

龙眼购自韶关市市场；芦丁标准品（福州飞净生物科技有限公司）；无水乙醇、NaNO2、Al（NO3）3及NaOH 均为分析纯（天津大茂化学试剂厂）；722S 型分光光度计（上海棱光技术有限公司）；AUY-220 型电子天平（日本岛津公司）；KQ-50B 型超声波清洗仪器（江苏昆山仪器有限公司）；SHD-Ⅲ型真空泵（保定市阳光仪器厂）.

1.2 试验方法

1.2.1 龙眼壳原料的处理

将废弃的龙眼壳清洗干净，自然晾干，80 ℃烘干，粉碎，过0.213 mm（80 目）的筛子，即为废弃龙眼壳粉末，待用.

1.2.2 龙眼壳黄酮的超声提取方法

准确称取一定量的废弃龙眼壳粉末，分别加入适量乙醇，超声提取一段时间，冷却至室温，离心，取上清液测定吸光度，计算废弃龙眼壳中的黄酮提取率.

1.2.3 标准曲线的绘制

准确称取25.0 mg 芦丁标准品，用50%（体积分数，下同）乙醇溶液完全溶解后转移到250.0 mL 容量瓶中，再用50%乙醇溶液稀释至刻度线并摇匀，即可得浓度为0.1 mg·mL-1的芦丁标准溶液，待用［12］.

分别量取芦丁标准溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 于25.0 mL 容量瓶中，各加入5% NaNO2溶液1.0 mL，摇匀静置6 min 后，各加入10% Al（NO3）3溶液1.0 mL，摇匀，静置6 min［13-14］，再各加入4%NaOH 溶液10.0 mL，摇匀后用乙醇定容，摇匀，静置15 min，在波长510 nm 处用分光光度计测其吸光度.绘制吸光度A随芦丁c（mg·mL-1）变化的标准曲线，得到回归方程为A=27.336c-0.004 71，R2=0.999 8.

1.2.4 龙眼壳中黄酮含量的测定

准确称取1.00 g 废弃龙眼壳粉末，加入25.0 mL 70%乙醇，超声50 min 后，冷却至室温，离心，取1.0 mL的上清液于25.0 mL 容量瓶中，加入1.0 mL 5% NaNO2溶液，摇匀，静置6 min，加入1.0 mL 10% Al（NO3）3溶液，摇匀，静置6 min［13-14］，再加入10.0 mL 4%NaOH 溶液，摇匀，再加入无水乙醇定容至刻度线，摇匀后静置15 min，在510 nm 波长处用分光光度计测定吸光度A，在标准曲线上查出相对于标准品的黄酮质量浓度c（mg·mL-1），按公式Y=c×1.0/（1.00×1 000）×25×100%计算黄酮提取率Y（%）. 式中，1.0 为所取上层清液体积，mL；1.00 为取样质量，g；1 000 为换算系数，mg·g-1；25 为返算倍数.

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 超声提取时间对黄酮提取率的影响

准确称取6 份1.00 g 龙眼壳粉末，分别加25.0 mL的70%乙醇，使液料比为25∶1，分别超声提取20、30、40、50、60、70 min，冷却至室温，离心，取1.0 mL 上层清液，按“1.2.4”方法测其吸光度，然后计算出龙眼壳中的黄酮提取率，考察超声提取时间对龙眼壳黄酮提取率的影响，结果见图1.由图1 可知，随着超声提取时间的增加，龙眼壳黄酮提取率逐渐增加，但是超声提取时间超过50 min 后，提取率反而下降，这可能是由于开始随着提取时间增加，龙眼壳黄酮能够充分溶解出来，所以黄酮含量逐步增加，但是提取时间超过50 min 后，长时间的超声作用会破坏龙眼壳黄酮的结构，降低黄酮的提取率，同时组织中大量破裂的细胞，增加了溶液中的杂质含量，使有效成分的溶出受到影响［15］，因而，选择50 min 为适宜的超声提取时间.

图1 超声提取时间对黄酮提取率的影响

2.1.2 乙醇体积浓度对提取率的影响

准确称取6 份龙眼壳粉末1.00 g，分别加入25.0 mL的体积浓度为40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液，使液料比25∶1，摇匀后，将其超声提取50 min，提取过程及黄酮测定方法同“2.1.1”，考察乙醇体积浓度对龙眼壳黄酮提取率影响，结果见图2. 由图2 中可知，随着乙醇体积浓度的增大，龙眼壳黄酮的提取率逐渐提高，但当乙醇浓度超过70%后，龙眼壳黄酮的提取率反而降低，这可能是由于开始随着乙醇体积浓度增加，龙眼壳中黄酮更容易溶解，但是乙醇体积浓度超过70%后，从废弃龙眼壳中溶出的一些亲脂类杂质反而抑制了黄酮的溶出［16］.

图2 乙醇体积浓度对黄酮提取率的影响

2.1.3 液料比对提取率的影响

准确称取6 份1.00 g 龙眼壳粉于锥形瓶中，分别按照10∶1、15∶1、20∶1，25∶1、30∶1 的液料比加入不同体积的70%乙醇，摇匀后超声提取50 min，提取过程及黄酮测定方法同“2.1.1”，考察液料比的改变对龙眼壳黄酮提取率的影响，结果见图3. 由图3 可知，随着液料比的增加，龙眼壳黄酮提取率逐步增大，直到液料比超过25∶1 后，提取率趋于稳定，这可能是由于开始随着液料比增加，使得龙眼壳粉末与乙醇溶液接触更充分，因此黄酮提取率也会随着提高［17-18］，但是当液料比超过25∶1 后，龙眼壳中的黄酮已在乙醇溶液中溶解达饱和，所以试验确定料液比为25∶1 较合适.

图3 液料比对黄酮提取率的影响

2.2 响应面试验设计

结合单因素试验结果，选取超声提取时间（A），乙醇体积浓度（B）和液料比（C）3 个因素为自变量，并以1，0，-1 代表自变量的高、中、低水平，以废弃龙眼壳黄酮提取率（Y）为响应值，参照Box-Behnken 试验设计原理，设计3 因素3 水平响应面试验的因素水平，如表1.

表1 响应面试验因素水平设计

2.3 响应面法分析及结果

根据Box-Behnken 试验方案，以超声提取时间（A），乙醇体积浓度（B）和液料比（C）3 个因素为自变量，龙眼壳黄酮提取率（Y）为响应值，设计了3 因素3 水平共17 个响应面试验，结果见表2，采用Design-Expert 8.0.6 软件对表2 数据进行二次多项式回归拟合分析［19-24］. 得到龙眼壳中黄酮提取率为响应值（Y）的二次多元回归方程为Y=-2.847 080+0.032 600A+0.059 678B+0.069 575C+1.665 330×10-18AB-1.400 000×10-4AC-5.000 000×10-6BC-2.772 500×10-4A2-4.097 500×10-4B2-1.179 000×10-3C2.

表2 响应面试验设计及结果

2.4 回归方程的方差分析

对回归方程进行显著性方差分析及误差统计分析，结果见表3 和表4［10，19-24］. 回归模型的F值为58.90，P＜0.01，表明回归模型极显著，回归方程拟合度好；失拟项的F值为2.17，P值0.234 7＞0.05，说明模型的失拟项差异不显著、误差由随机误差而引起、该模型与试验有良好的拟合性；相关系数R2为0.987 0，表明预测值与试验值之间具有较高的相关性；校正系数R2Adj为0.970 2，预测系数R2Pred=0.863 2 且R2Adj-R2Pred＜0.2，两个系数值高且接近，说明回归模型能充分说明试验过程；模型的变异系数CV值为0.64%＜10%，表明试验可信度和精确度高；精密度（Adeq Precision）=21.466＞4，视为合理，也从另外一个角度表明此方程模型可信度高，能很好地描述本次试验结果，因此可用该模型来优化龙眼壳中黄酮提取条件.

表3 方差分析结果

表4 误差统计分析表

同时根据表3 中的P值大小可以看出，一次项A、B、C均对响应值Y的影响极显著（P＜0.01）；模型交互项AC、AB、BC均对响应值的影响不显著（P＞0.05）；模型二次项A2、B2、C2对响应值的影响均极显著（P＜0.01）. 因此，各因素对响应值的影响不是简单的线性关系. 由F值大小可知，各因素对龙眼壳中黄酮提取率的影响顺序为：B（乙醇体积浓度）＞C（液料比）＞A（超声提取时间）.

2.5 响应面图和等高线图分析

根据拟合的二次回归方程可绘制各影响因素之间的三维立体响应面图和等高线图，可直观显示相关因素对响应值（龙眼壳黄酮提取率）的交互影响作用，其中响应面的坡度越陡峭，表明该因素对响应值的影响越大；且等高线图的形状越接近椭圆，表明两因素间的交互作用越明显［10，19-24］. 具体见图5～图7.

图5 超声提取时间和液料比交互作用的响应面和等高线

由图5 可知，响应面中液料比曲线比超声提取时间更为陡峭，说明液料比对响应值（龙眼壳黄酮提取率）的影响比超声提取时间大，但从两者的等高线图形状可以看出，超声提取时间和液料比的交互作用对响应值的影响不太显著，这与表3 中的方差分析结果相符.

由图6 可知，响应面中乙醇体积浓度曲线比超声提取时间更陡峭，说明乙醇体积浓度对龙眼壳黄酮提取率的影响比超声提取时间大，但从两者的等高线图形状可以看出，超声提取时间与乙醇体积浓度的交互作用对龙眼壳黄酮提取率的影响不显著，这与表3 中的方差分析结果相符.

图6 超声提取时间和乙醇体积浓度交互作用的响应面和等高线

由图7 可知，响应面上乙醇体积浓度曲线的陡峭程度比料液比大，说明乙醇体积浓度对龙眼壳黄酮提取率的影响比液料比大. 但从两者的等高线图形状可以看出，乙醇体积浓度与液料比的交互作用对龙眼壳黄酮提取率的影响不显著，这与表3 中的方差分析结果相符.

图7 乙醇浓度和液料比交互作用的响应面和等高线

2.6 验证优化条件

经过Design-Expert 8.0.6 软件分析预测，在超声提取时间为52.16 min，乙醇体积浓度为72.66%，液料比为26.25∶1 的条件下，可从废弃龙眼壳中得到最大的黄酮提取率为1.085%. 为了检验预测结果与真实情况是否吻合，我们进行了验证试验. 考虑试验实际操作情况，将条件数据四舍五入，调整超声提取时间为52 min，乙醇体积浓度为73%，液料比为26∶1；在此条件下，分别进行3 次试验，测得实际的废弃龙眼壳中黄酮的提取率为1.071%、1.075%、1.078% ，取平均值约为1.075%，与预测结果相近，说明应用响应面法来优化提取废弃龙眼壳中黄酮，具有较好的实用价值.