地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌对银杏叶发酵的初步研究

陈建荣，陈锦灵

（1.韶关学院 生物与农业学院，广东 韶关 512005；2.南昌大学 玛丽女王学院，江西 南昌 330031）

银杏（Ginkgo bilobaL.）是中国特有而丰富的经济植物，适应性强，有较高的观赏价值和经济价值. 银杏富含黄酮类化合物和萜类化合物，富含多糖、氨基酸、多种微量元素等成分，临床应用价值较高，具药用、保健、食用、材用、观赏于一体［1］. 银杏叶含有有机酸类、黄酮类、萜内酯类、酚类、烷基酚酸类、醇类物质以及甾类等各种化学活性成分高达160 余种. 用银杏叶制作的饲料添加剂符合国家要求，银杏叶提取物具有显著的免疫调节功能和抗氧化应激能力，能抑制多种病原微生物，提高动物的生长性能［2］. 但银杏叶提取物的价格昂贵，使银杏叶在应用中受到限制，但直接利用银杏叶作为饲料添加剂，其适口性差，叶中的纤维素、半纤维素等难以被禽类利用［3-4］.

地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）是一种相对比较常见的革兰氏阳性细菌，能产生多种活性酶，如蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、葡聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶等，具有降解食物中碳水化合物的作用［5-7］. 纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）是嗜氧菌，能生成多种蛋白酶（特别是碱性蛋白酶）、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，降解植物性饲料中某些复杂的碳水化合物，从而提高饲料的转化率［8-10］.两种菌均是绿色安全无污染的饲料添加剂.

研究地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌发酵银杏叶，改善银杏叶饲喂的适口性和营养成分，可以有效利用银杏叶来促进鸡的生长和提高鸡的防病治病能力［2］. 此研究既符合国家产业政策和投资方向，又能促进地方经济发展，具有明显的经济效益、生态效益和社会效益.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试验材料

银杏叶（韶关银杏树种植区）；地衣芽孢杆菌活菌颗粒（东北制药集团沈阳第一制药厂，活菌数109cfu·g-1）；纳豆芽孢杆菌（广州农冠生物科技有限公司，活菌数0.5×109cfu·g-1）.

1.1.2 培养基

肉膏蛋白胨琼脂（NA）培养基，淀粉培养基，活化斜面培养基，种子培养基（3.0%葡萄糖+4.0%蛋白胨+0.5 % NaCl+ 0.5 %牛肉膏+ 0.5 %酵母膏），液体发酵培养基（100 mL 豆浆+2.0 %葡萄糖+0.5 % NaCl+2 % NaOH）.

1.2 方法

1.2.1 地衣芽孢杆菌培养

取0.25 g 地衣芽孢杆菌活菌颗粒溶于2.25 mL 无菌水中，震荡5 min，然后进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7浓度稀释. 在低温无菌培养环境下，用高压灭菌后的移液管取0.1 mL 的10-5、10-6、10-7倍稀释液滴于无菌牛肉膏蛋白胨培养基中，用经过高压锅灭菌的消毒涂布器在无菌培养基上均匀涂抹，然后在37 ℃恒温箱中倒置无菌培养48 h 后，仔细观察3 个不同浓度下菌落，就其正常形态、生长发育变化情况等进行记录，选择生长较好、形态比较完整的菌落来发酵银杏叶.

1.2.2 纳豆芽孢杆菌的培养

纳豆菌制备：用接种环挑取少量纳豆表面的黏性物质，并移至装10 mL 无菌水的试管中充分搅拌，制成悬浊液. 取少量悬浊液，在活化斜面培养基平板上涂划线，置35 ℃培养箱中恒温培养24～48 h 后，挑取少量平板上长出的有拉丝的菌落，镜检观察为纳豆菌. 继续划线纯化2～3 次，挑取单菌落，于种子培养基中保存.

菌悬液制备：从斜面上挑取几环菌种接入装有70 mL液体发酵培养基的三角瓶中，于35 ℃，100 r·min-1摇床振荡培养16～24 h 的种子菌悬液，待用.

纳豆菌扩大培养：将制得的种子菌悬液以4%～6%的接种量接于液体发酵培养基中，在35 ℃，pH 7.0条件下培养24 h.

1.2.3 银杏叶发酵

将干燥银杏叶用粉碎机粉碎后进行高压灭菌，分别将地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌接种环挑出菌落，接入含37 ℃的20.8%葡萄糖溶液的烧杯中，搅拌，活化30 min，加入银杏叶100 g、硫酸铵10.4 g、维生素0.416 g、硫酸钾0.416 g，混合均匀，补充37 ℃温水至200 mL，用呼吸膜包装密封，放入恒温箱，在35～37 ℃下发酵5 d.记录发酵前后银杏叶的颜色和气味，并测定发酵前后的pH 值、细菌总数、粗纤维、粗蛋白等.

1.2.4 检测方法

pH 值：GB 5009.239—2016 食品安全国家标准 食品酸度的测定［11］；

细菌总数：GB/T 13093—2006 饲料中细菌总数的测定［12］；

粗纤维：GB/T 6434—2022 饲料中粗纤维的含量测定［13］；

粗蛋白：GB/T 6432—2018 饲料中粗蛋白的测定［14］.

2 结果与分析

2.1 地衣芽孢杆菌发酵效果评价

从表1 可知，地衣芽孢杆菌发酵银杏叶后，细菌总数显著提高，说明地衣芽孢杆菌能很好地在银杏叶上发酵生长；发酵前，银杏叶为翠绿色，有抹茶味，发酵后银杏叶为棕褐色，酸味及茶味浓厚；发酵前pH值为4.8，发酵后为4.0，下降了0.8；发酵使银杏叶酸性变强，茶味变浓，能在一定程度上促进食欲.

表1 地衣芽孢杆菌发酵银杏叶的感官及营养成分变化

同时，从表1 还可知，发酵后粗蛋白含量由11.17%提升为20.12%，提升了80.1%，说明地衣芽孢杆菌发酵后，能较大程度提升粗蛋白的含量及利用率；发酵后银杏叶的总纤维数含量由1.06%下降到0.21%，下降了80.2%，说明通过地衣芽孢杆菌发酵，能较大程度地降解掉银杏叶中的纤维，进一步改善银杏叶的饲料适口性.

2.2 纳豆芽孢杆菌发酵效果评价

从表2 可知，纳豆芽孢杆菌发酵银杏叶后，细菌总数也有所提高，说明纳豆芽孢杆菌能在银杏叶上发酵生长；纳豆芽孢杆菌发酵后，银杏叶由翠绿色、抹茶味变为棕黄色、淡酸味及淡茶味，pH 值从4.8 降为4.6，降幅不大，但纳豆芽孢杆菌发酵银杏叶也能在一定程度上增进食欲.

表2 纳豆芽孢杆菌发酵银杏叶的感官及营养成分

同时，从表2 还可知，发酵后粗蛋白含量由11.17%提升为15.65%，提升了14.7%，一定程度提升粗蛋白的含量及利用率；发酵后银杏叶的总纤维数含量由1.06%下降到0.88%，下降了17.0%左右，说明通过地衣芽孢杆菌发酵，能在一定程度上降解银杏叶中的纤维，一定程度上改善银杏叶的饲料适口性.

2.3 地衣芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌发酵银杏叶效果比较

2.3.1 地衣芽孢杆菌发酵后细菌总数、粗蛋白含量都高于纳豆芽孢杆菌

地衣芽孢杆菌含有丰富的酶类，如果胶酶、葡聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶等，这些酶类可以将淀粉、纤维素和蛋白质等分解成小分子糖 、氨基酸 、醇类等易被消化和吸收的低分子物质［7］. 纳豆芽孢杆菌能生成多种蛋白酶（特别是碱性蛋白酶）、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，降解植物性饲料中某些复杂的碳水化合物等成分［10］. 从表1 和表2 可知，使用2 种菌发酵，都能使银杏叶中的粗蛋白和细菌总数得到提高，银杏叶的营养成分得到提高，但地衣芽孢杆菌效果更好.

2.3.2 发酵后总纤维、总黄酮都有所下降

地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌都含有淀粉酶等多种可降解植物纤维素的酶类［7，10］，发酵后的银杏叶纤维含量都有所下降，特别是地衣芽孢杆菌更能有效地降低纤维含量，提高饲料的适口性.

另外，由于纳豆芽孢杆菌好氧，在密闭容器中发酵时发现，发酵效果不理想，因此，综合考虑，为提升银杏叶作为饲料的适口性及效果，建议用地衣芽孢杆菌来发酵银杏叶，不建议用纳豆芽孢杆菌来发酵银杏叶.

3 结论

研究表明，地衣芽孢杆菌发酵能有效提高银杏叶的细菌总数、粗蛋白含量，降低纤维含量，改善银杏叶作为饲料的适口性；纳豆芽孢杆菌也能一定程度提高银杏叶的细菌总数、粗蛋白含量并降低纤维含量，改善银杏叶的适口性，但效果没有地衣芽孢杆菌明显；同时纳豆芽孢杆菌因好氧，在密闭环境中不能很好地发酵，所以不建议用于银杏叶的发酵.