盐胁迫下野菊离子的吸收转运情况及相关基因的表达1)

罗玢晔 陈胜艳 杨宇佳 薄杉 孙颖

(东北林业大学,哈尔滨,150040)

由于全球气候暖化和人类活动加剧,全球土壤盐渍化问题日益严重,据统计,全球受盐碱化威胁的土壤面积约占7%[1],且这一数字还在持续攀升。盐碱化严重的土质会导致植物体发生渗透胁迫,造成离子毒害,从而影响植物生长,甚至枯萎死亡[2],严重影响园林绿化效果,不利于社会发展[3]。但植物中的高抗盐类群对盐碱化土壤有良好的适应性,在盐碱土上依然有着较好的观赏效果[4]。所以研究植物类群抗盐机理,有利于改善植物的抗盐性,促进土壤盐碱化严重地区的园林事业发展。

野菊(Chrysanthemumindicum),属于菊科(Compositae)菊属(DendraothemasGaertn.)植物,在我国大部分地区广为分布[5]。菊花是我国传统名花,花色丰富、形态各异,在园林绿化中被广泛运用,具有较高的文化价值、观赏价值与经济价值[6]。野菊与其他菊花品种有较近的亲缘关系,但野菊生于野外,与其他菊花品种相比,具有适应性强、育种潜力高等优点[7]。但目前对野菊的研究集中在栽培育种、化学成分分析、遗传特性和药用价值等方面,对其抗盐性等方面的研究较少。所以研究野菊的抗盐性,对于改善菊花抗盐性,选育菊花耐盐品种具有重大意义[8-9]。

植物为适应高盐环境,自身会启动一定的调节机制,主要通过离子区域化、选择性吸收和分配等方式来抵御不利影响,维持离子稳态[10]。非盐生植物通过控制盐离子的吸收或者把盐离子转移到较老的组织器官或根部,以有效地隔离盐离子,保护那些代谢较强的组织免受影响[11-12];盐生植物通过增加根冠比更大限度地保留盐离子,控制它们向地上部分转移[13]。抗盐性强的植物能够通过减少体内K+、Ca2+等营养离子的流失,并控制Na+的含量,以维持K+、Ca2+的吸收与代谢过程能够正常进行[14-15]。Yang et al.[16]的研究表明维持细胞w(K+)∶w(Na+)值稳定是耐盐植物对过量离子反应的重要适应特征。同时,在这一过程中,许多基因的表达都扮演着不容忽视的角色。Na+和H+逆向转运蛋白基因(NHX)和高亲和性钾离子转运蛋白基因(HKT)是在植物体内参与离子转运调节的重要蛋白基因,在植物抗逆性方面的作用一直为人们广泛关注。NHX基因家族介导Na+和H+的跨膜运输,促进Na+在液泡中的区隔作用,调节植物体内Na+的平衡,维持植物的离子平衡与正常的生理代谢活动[17-18]。HKT蛋白是高亲和性钾转运体,是一种在质膜上具有Na+和K+双重转运功能的离子运输体,介导植物体内Na+长距离运输以及维持K+和Mg2+动态平衡,在逆境胁迫中起着重要作用[19-20]。

课题组前期引进了207个野菊株系,完成了野菊抗盐株系的筛选,并分析其中6个株系在盐胁迫下的表型、光合生理及渗透调节物质的变化情况,初步探明野菊的抗盐机理[21]。因此,本研究重点关注盐胁迫下,6个抗盐性不同的野菊株系各部位离子质量分数、比例、运输情况的变化;并在鉴别出野菊NHX基因家族成员的基础上,利用实时荧光定量PCR技术,分析不同时间点CiNHX1-6基因、CiHKT1基因在盐胁迫下的表达水平。以明确盐胁迫下植物体内的离子分布运输情况及相关基因表达的变化规律,旨在从更深层次上认识植物的抗盐机理,对研发和培育新的抗盐品种,提高育种效益意义重大。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

试验材料选取前期筛选的2个高抗株系[21]3-25-2(H1)、4-4-6(H2);2个中抗株系3-18-3(M1)、2-13-2(M2);2个低抗株系5-11-2(L1)、4-7-2(L2)。

选取顶端生长良好的野菊取其茎段,以珍珠岩为基质,进行扦插繁殖,置于温室中生长。直至扦插苗根长1～2 cm时,取长势一致的野菊扦插苗,根部用蒸馏水洗净,并适当修剪使每个单株保留4～6片真叶。将处理好的野菊扦插苗置于霍格兰营养液中水培,2 d更换1次营养液,水培7 d后,将处理组野菊株系置于含有NaCl(浓度为150 mmol/L)的霍格兰营养液中进行盐胁迫处理,对照组仍采用霍格兰营养液培养。每组设置3个重复,每个重复为15株。

在盐处理后0、12、24、72 h,对野菊各株系的根、茎、叶分别取样。样品放于冰箱中-80 ℃保存,用于后续试验。每个取样时间设置3个生物学重复。

1.2 Na+、K+离子质量分数的测定

盐胁迫72 h后,野菊用蒸馏水清净,用信封分别包好根、茎、叶,置于烘箱内105 ℃杀青15 min,75 ℃烘干至恒质量,用研钵研磨烘干后的样品至粉末状,100目过筛,称取0.1 g烘干过目后的样品,参考刘松[22]的方法进行消解。用安捷伦特微波等立子体MP-4200测定Na+、K+离子质量分数,并计算各株系中根、茎、叶钾钠离子质量分数比值(w(K+)∶w(Na+))。

参考乌凤章等[23]的方法对野菊不同部位离子选择性运输能力S(K+,Na+)进行计算：

S(K+,Na+)=库器官{w(K+)∶w(Na+)}/
源器官{w(K+)∶w(Na+)}。

式中：Na+、K+,分别表示Na+、K+离子质量分数,单位为mg/g。

1.3 野菊NHX家族成员鉴定

由于野菊未有基因组数据公布,因此利用菊花脑与甘野菊(Chrysanthemumseticuspe)基因组数据库进行比对[24]。从TAIR数据库(https：//www.arabidopsis.org/)获得8个拟南芥AtNHXs基因的序列,对菊花脑与甘野菊基因组进行蛋白序列比对(BLASTP),搜索出候选的CiNHXs[25]。然后利HMMER3.0软件进行比对分析,比对结果经Pfam(http：//pfam.xfam.org)、CDD(https：//www-ncbi-nlm-nih-gov.webvpn.nefu.edu.cn/cdd)和SMART(http：//smart.embl)进行验证,去除不含Na+和H+交换保守结构域的蛋白序列,获得6个野菊的NHX基因家族成员,按照其在染色体上的位置依次命名。

结合自然的交际语境设计词汇的教学、段落文章的教学，并且根据不同的语境设置学生练习的内容。在语境中教学不仅可以使学生在语境中学习语言知识的运用，还可以培养学生判断理解的能力，在语境中更进一步地理解语用理论，消化潜在的理论知识并潜移默化地将其付诸实践[4]。

1.4 总RNA提取与荧光定量PCR

采用E.Z.N.A Plant RNA Kit (OMEGA)试剂盒提取野菊的总RNA,随后用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO)试剂盒将总RNA反转录为cDNA。通过荧光定量PCR技术,测量样品Na+和H+逆向转运蛋白基因(NHX)：CiNHX1-6、高亲和性钾离子转运蛋白基因(HKT)：CiHKT1的表达量。以CmEF1α为内参基因。每组3个重复。

1.5 数据处理

数据的统计和计算采用Excel 2013,数据分析采用SPSS 22.0,系统聚类分析采用TBtools。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对野菊离子分布与运输的影响

2.1.1 盐胁迫对野菊各部位离子质量分数的影响

盐胁迫会导致大量的Na+和Cl-进入植物体内,导致有害离子过度积累,并影响植物对其他有益离子的吸收和离子平衡,造成离子毒害。据表1数据显示,各株系在正常生长时,Na+和K+的质量分数相差不大。然而盐胁迫后,与对照组相比,处理组的各株系的根、茎和叶的Na+质量分数均显著增加(P<0.05),同时与对照组相比,K+质量分数均显著降低(P<0.05)。其中根系Na+质量分数高于茎和叶,且根系Na+质量分数随着株系盐能力的降低而不断增加。H1、H2、M1、M2株系的K+质量分数为叶高于根高于茎,而L1株系的K+质量分数为根高于叶高于茎,L2株系的K+质量分数为根高于叶高于茎。不同株系中同一部位的Na+和K+质量分数也存在显著差异(P<0.05)。随着株系抗盐能力的降低,根、茎和叶中的Na+质量分数呈持续上升趋势,而K+质量分数则呈持续下降趋势。

表1 盐胁迫下野菊各器官Na+、K+质量分数的变化

2.1.2盐胁迫对野菊各器官w(K+)∶w(Na+)值的影响

维持植物内部离子平衡对于其正常生理代谢至关重要,而钾钠离子质量分数比值(w(K+)∶w(Na+))是反映离子平衡的重要指标。据表2数据显示,在受到盐胁迫后,与对照组相比,处理组各株系根、茎、叶的w(K+)∶w(Na+)值均显著降低(P<0.05);随着株系抗盐能力的降低,根中w(K+)∶w(Na+)值较对照组分别降低了76.42%、82.95%、89.63%、92.81%、95.72%、96.02%,茎中w(K+)∶w(Na+)值较对照组分别降低了70.67%、83.14%、87.07%、93.62%、95.91%、96.59%,叶片中w(K+)∶w(Na+)值较对照组分别降低了59.28%、72.53%、83.73%、91.48%、95.99%、98.29%。在处理组中,除L2株系外,其他株系的叶片中w(K+)∶w(Na+)值均高于茎和根。同株系中同一部位的w(K+)∶w(Na+)值也存在显著性差异(P<0.05)。由此可见,随着株系抗盐能力的降低,根、茎、叶的w(K+)∶w(Na+)值均呈持续下降趋势。

表2 盐胁迫下野菊各器官钾钠离子质量分数比值的变化

2.1.3盐胁迫对野菊各部位间离子选择性运输能力的影响

表3 盐胁迫下野菊各部位间离子选择性运输能力的变化

2.2 盐胁迫对野菊NHX、HKT基因相对表达的影响

2.2.1 盐胁迫对野菊CiNHX基因相对表达的影响

Na+和H+逆向转运蛋白(NHX)基因,具有保守的Na+和H+交换结构域。可以将细胞内过多的Na+区域化或排出体外,维持细胞内的正常Na+质量分数。试验测定了6个抗盐性不同的野菊株系根、茎、叶中CiNHX1-6基因在盐胁迫下不同时间点的表达水平,结果如表4所示。

盐胁迫后,野菊CiNHX2基因在株系H1的根中,株系M1的叶中均出现较高的相对表达量,盐胁迫处理24 h时分别达到了9.96、12.03,是未胁迫的7.84、11.04倍。该基因在株系H1、H2根中的表达丰度远高于抵抗株系,且上调幅度大于茎和叶,说明该基因在根中发挥的作用大于茎和叶。盐胁迫后,野菊CiNHX4基因的相对表达量在株系H1、H2的根、叶中出现了大幅上调,明显高于其他株系,盐胁迫处理24 h时分别达到了11.43、12.27、10.60、17.72,是未胁迫的8.66、14.44、9.72、10.55倍。与未胁迫相比,盐胁迫处理12、24 h时,6个株系根、茎、叶中CiNHX1、CiNHX3、CiNHX5、CiNHX6基因相对表达量均未出现明显变化,表达水平介于0.81～3.68,均处在较低的表达水平。其中CiNHX3在根部的相对表达量略高,CiNHX1、CiNHX6在叶部的相对表达量略高。

以上结果表明野菊CiNHX2、CiNHX4基因受盐胁迫的影响明显,在盐胁迫下被激活,提高了盐胁迫下野菊的抗盐能力;CiNHX1、CiNHX3、CiNHX5、CiNHX6基因在野菊体内表达水平整体较低,与野菊株系抗盐性强弱关系不大,在野菊株系抗盐的过程中未发挥重要作用。

2.2.2 盐胁迫对野菊CiHKT1基因相对表达的影响

HKT类蛋白是高亲和性K+载体,编码Na+、K+转运或K+-Na+共转运质膜通道蛋白[26],在维持Na+、K+平衡等方面发挥着重要作用。

盐胁迫下野菊CiHKT1基因相对表达量的变化如表5所示,CiHKT1在根、叶中的表达受盐胁迫的影响较为明显,高抗株系的表达量出现一定程度的上调。其中,株系H1、H2的叶片在盐胁迫处理24 h后的相对表达量大幅上调,达到了10.38和6.26,是未胁迫的7.75和7.63倍,说明该基因在野菊响应盐胁迫的过程中发挥了一定的作用。盐胁迫处理12 h时,CiHKT1在株系H1、H2根中的表达量高于盐胁迫处理24 h时的表达量,说明该基因可在根中短时间内被激活并大量表达。

野菊CiHKT1基因在根、叶中的表达受盐胁迫的影响较为明显,高抗株系的相对表达量大幅上调,说明CiHKT1基因与野菊株系的抗盐性强弱密切相关,是野菊抵御盐胁迫的关键基因。

3 讨论与结论

盐胁迫导致的离子毒害、水分缺失和激素失调会对植物的生长发育产生负面影响[27]。为了对抗高盐胁迫的影响,植物会启动多种抗逆反应,例如限制Na+进入根,将Na+从根细胞中排除,以及将Na+区隔化于液泡中等方式,以降低盐胁迫对细胞内其他生理活动的有害影响[28-29]。本研究结果显示,处理组中各株系的根、茎和叶的Na+质量分数均高于对照组,表明盐胁迫导致野菊吸收了大量的Na+且遍布体内。但处理组中株系的抗盐性越强其体内的Na+质量分数越低,表明盐胁迫下抗盐性较强的株系能更好地外排Na+,一定程度上减轻了Na+的毒害作用。处理组中,同一株系中的Na+质量分数由高到低均为根、叶、茎,表明野菊将Na+集中在根部,减少对茎、叶的损害,以保持正常的营养物质运输和光合作用。Na+和K+二者的分子相似性导致K+易被Na+取代,但Na+并不能代替K+在植物体内的生理生化功能[30]。K+在维持离子平衡、渗透压和细胞膨压等生理功能方面起重要作用[31]。本研究结果显示,处理组中各株系的根、茎和叶的K+质量分数均低于对照组,表明盐胁迫阻碍了野菊对K+的吸收和向各部位的转运。处理组中,抗盐性越弱的株系根、茎、叶中K+降低幅度越大,且在株系L1、L2中,叶片中的K+质量分数低于茎和根,表明盐胁迫下抗盐性越弱的株系吸收和转运K+的能力越弱,低抗株系没有充足的K+来支持正常的生理活动,叶片受到的影响最为严重。

植物需要维持正常的钾钠离子质量分数比以进行正常的生理活动,w(K+)∶w(Na+)值也是反应植物抗盐性的指标之一[32]。本研究结果显示,与对照组相比,处理组各株系的根、茎和叶的w(K+)∶w(Na+)值均有不同程度的降低,抗盐性越弱的株系降低幅度越大,说明w(K+)∶w(Na+)值与野菊的抗盐性密切相关,这与路斌等[33]的研究结果一致。可能是因为抗盐株系根系的ATPase酶活性增加,促进了植物体对K+的吸收和转运,同时刺激增加了质膜上Na+和H+逆向转运蛋白的活性,减少了Na+的吸收并促进了其外排。与对照组相比,处理组株系L2的w(K+)∶w(Na+)值降低幅度较大,而叶片的w(K+)∶w(Na+)值低于茎和根,表明低抗株系在盐胁迫下离子平衡被严重破坏,Na+的外排与区域化和K+的吸收与转运受到严重影响,这可能是其叶片枯黄率增加和萎蔫的原因之一。

离子转运系数是反映离子向上选择性运输的指标[21]。植物的不同部位离子选择性运输能力(S(K+,Na+))可以反应植物将K+向地上部分输送和将Na+控制在根中的能力,也可反应植物的抗盐性[34]。本研究结果显示,在处理组中,H1、H2、M1、M2株系的根-茎、茎-叶和根-叶的S(K+,Na+)较对照组有所上升或变化不大,L1、L2株系的根-茎、茎-叶和根-叶的S(K+,Na+)低于对照组,各株系根-茎、茎-叶和根-叶的S(K+,Na+)均呈现先升高后降低的趋势。这表明在盐胁迫下高抗株系具有较强的Na+外排和K+选择性吸收能力,因此其离子的转运和吸收受到的影响较小;中抗株系受胁迫的影响相对较大,吸收了较多的Na+,但通过选择性运输可以防止过多的Na+对地上部分造成毒害,从而保证生理活动能够基本正常进行;低抗株系的调节能力较弱,其膜系统受到严重破坏,生理活动相关酶活性明显降低,导致大量Na+进入并分布在体内,影响了K+的吸收和运输,从而影响整体生长情况。

在盐胁迫期间,许多通道、转运蛋白和反转运蛋白在维持高等植物细胞pH、K+和Na+稳态发挥作用[35],其中之一是Na+和H+逆向转运蛋白(NHX)[36]。Na+和H+交换蛋白跨膜参与细胞内外Na+和H+的交换,在植物、藻类和真菌的液泡中较为活跃[37-39]。本研究结果显示,在盐胁迫下,CiNHX2和CiNHX4基因在野菊的体内都有一定程度的上调,尤其在高抗株系中上调的幅度明显,CiNHX2基因在高抗株系的根和茎中表达模式相同,而CiNHX4基因在高抗株系的根和叶中表达模式相同。说明CiNHX2和CiNHX4的表达与野菊株系的抗盐性密切相关,据此推测CiNHX2和CiNHX4在植物维持离子平衡、减轻离子毒害过程中起着重要作用。对拟南芥和水稻的广泛研究已经证明了NHX在耐盐性中发挥的关键作用,OsNHX1过度表达显示转基因植物对盐胁迫有更高的耐受性,从而提高耐盐性[40-42];盐胁迫后香蕉体内部分NHX基因的表达明显上调[43],与本研究结果相似。

与NHX相比,高亲和力的K+转运蛋白(HKT)基因编码了Na+和K+的转运系统,在质膜上起作用[44]。拟南芥盐胁迫适应性的关键蛋白--AtHKT1;1通过将流入木质部的Na+卸载到木质部实质细胞中来促进地上部分向地下部分的运输,并通过韧皮部还流抑制Na+从地下部分向地上部分运输[45]。已有研究表明,在拟南芥中AtHKT1;1的过度表达可提高其耐盐性[46];AtHKT2;1基因可以控制Na+和K+的吸收和空间分布,从而最终调控了植物在盐胁迫下的生长[47]。本研究结果显示,在受到盐胁迫后,CiHKT1基因在野菊的根和叶中的相对表达量明显上调,高于低抗株系,这说明CiHKT1的高表达在一定程度上提高了野菊株系的抗盐性。推测CiHKT1对野菊的K+转运具有很强的亲和性,可以使高抗株系在盐胁迫下维持正常的K+质量分数,进而维持正常的生理代谢活动。