杨树烂皮病生防菌株X4筛选与鉴定1)

王朝政 张巨涛 刘桐岐 李弘泽 苏芳葶 周博如

(东北林业大学,哈尔滨,150040)

杨树(PopulusL.)是我国广泛栽培的树种之一。由污黑腐皮壳菌引起的杨树烂皮病是一种引起树势衰弱的重要枝干部病害。目前,该病当下的防治手段以化学防治为主,其他的防治手段有抗病品种的选育,都具有一定的缺点,如抗病品种的培育周期长、成本大、培育出的抗病品种繁育多代后存在抗病退化、抗病能力不高等问题[1]。化学试剂的使用往往伴随对生态环境平衡的破坏以及污染等问题[2],此外化学药剂若使用不当会对植物产生损害,直接毒害非靶标生物(包括有害生物的天敌以及有益微生物),同时还有致使病原菌产生抗性等问题。因此,结合我国现实背景以及发展需要,研究生态系统综合可持续发展的思路势在必行[3],通过对自然界中天然存在的拮抗细菌的利用来防治烂皮病以维护生态系统平衡的同时高效地抑制有关病害为最终目标。

以芽孢杆菌属(Bacillussp)菌株作为拮抗菌株是近年来生防菌研究的一大热点。芽孢杆菌属菌株普遍拥有对目标病原菌抑制性强、抑菌谱广的特点。其对于植物内在激素的影响亦能提高植物本身的抗逆性,以多种途径起到抑制目标病害的作用。贝莱斯芽孢杆菌是广泛存在于自然界环境中的具有广泛功能性的一种细菌,在农业、工业甚至生物医学上都有应用,如作为生防菌抑制水稻稻瘟病菌[4];其含有的多种酶类包括：内切纤维素酶、木质素酶和果胶酶等,而在这些酶种中内切纤维素酶的含量最高,在饲料添加剂、洗涤剂和造纸行业都有应用[5],甚至分解孔雀石[6];其提取物(EPS化合物)具有抗癌能力且对健康的宿主细胞没有影响[7-8]。近年来,国内外研究表明贝莱斯芽孢杆菌可有效防治花生白绢病、鹰嘴桃腐败真菌、芋头干腐病、黄曲霉菌,甚至葡萄球菌及海产品防腐等多种病害和病原菌[9-14]。其生物防治机理已被明确[15]。本研究从黑龙江省尚志市帽儿山实验林场后山患病杨树根际土壤处分离出一株拮抗效果良好的细菌X4,并探索X4生理生化特性,初探其对于杨树烂皮病的防治潜力。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌株：松球壳孢(Sphaeropsissapinea)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)、交链格孢(Alternariaalternata)、希金斯炭疽菌(Colletotrichumhigginsianum)、杨灰星叶点霉(Phyllostictapopulea)和污黑腐皮壳菌(ValsasordidaNit),供试菌均由东北林业大学森林生态系统可持续经营教育部重点实验室提供;生防菌株为利用稀释法从东北林业大学实验林场及帽儿山实验林场健康及患杨树烂皮病的病株根围处得到。

1.2 生防菌的分离纯化和筛选

生防菌的分离纯化。参考许帅等[16]的方法分离土壤样品中的芽孢杆菌;利用平板划线法分离纯化出不同形态单菌落,冰箱4 ℃保存备用。

生防菌的筛选。参考张宁等[17]的方法进行生防菌筛选,以污黑腐皮壳菌为靶标菌,使用平板对峙法筛选出对靶标菌具有显著拮抗效果的细菌。利用下列公式计算抑菌率,筛选对杨树烂皮病菌具有拮抗效果的生防菌株。

抑菌率=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌块直径)]×100%。

1.3 菌株的观察

生防菌株X4菌落特征。将筛选出的拮抗菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上用接种环进行划线,25 ℃培养72 h,观察记录菌落特征并进行革兰氏染色试验置于光学显微镜下观察。

杨树烂皮病菌的扫描电镜观察。电镜样品的制备及观察：(1)用打孔器打取带有目标菌丝的牛肉膏蛋白胨培养基,置于容器中后倒入2.5%戊二醛固定液;(2)用磷酸缓冲液清洗2～4 h重复3次;(3)用1%饿酸处理样品4～6 h,缓冲液清洗样品3次,用不同体积分数的乙醇进行梯度脱水各1次,100%乙醇冲洗2次,15～20 min/次,乙酸异戊酯置换2次,每次20 min;(4)室温干燥,此时样品制作完成;(5)将样品黏在贴有导电胶带的载物台上喷金后上电镜观察。

1.4 生防X4菌株的鉴定及效果测定

生理生化鉴定。使用试剂盒对生防菌菌株进行革兰氏染色等试验[18],参照东秀珠和范俐[19-20]的方法进行乙酰甲基甲醇试验(V-P t测试)及乳糖、柠檬酸盐、甘油利用试验,参照夏明聪等[21]的方法进行蛋白酶活性等生化特性的测定。对东北林业大学帽儿山实验林场杨树根际土壤筛选出的拮抗细菌菌株的初步鉴定实验可参照《常见细菌系统鉴定手册》[19]和《伯杰细菌鉴定手册》[22]进行。

分子生物学鉴定。参考张宁等[17]的方法进行。利用DNA提取试剂盒提取菌株的基因组DNA,用细菌通用引物27-F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492-R(5’-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3’)扩增出菌株的16S rDNA基因序列。将PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序,所得的测序结果与NCBI数据库进行BLAST比对,获得同源序列,以邻接法使用Mega 7.0软件构建系统发育树。

菌株X4抑菌谱测定。参照1.2中的方法平板对峙法测定菌株X4对其他6种病原菌的抑制作用。

菌株X4生防效果测定。参照乔国彪等[23]和宿静瑶等[24]的方法,利用烫伤接种法测定菌株在杨树枝条上对杨树烂皮病的拮抗活性。选取若干2年生健康杨树枝条,截成10 cm左右粗细相似的短枝,用2%次氯酸钠浸泡10 min,75%酒精浸泡1 min,无菌去离子水冲洗3次后晾干。用石蜡将枝条两端封住以避免营养物质和水分流失。在枝条中间部位用无菌打孔器打孔致出现直径为6 mm的伤口,将于28 ℃、180 r·min-1培养48 h的X4拮抗菌菌液装入喷壶并均匀喷施在枝条上,于0.5 h后将杨树烂皮病菌菌饼贴在伤口上,用无菌脱脂棉包裹并使用保鲜膜封口,定时喷水保持无菌脱脂棉湿润。本试验中的阴性对照处理为不接种杨树烂皮病菌的枝条致伤后喷施LB液体培养基,阳性对照除此之外枝条伤口处还贴杨树烂皮病菌菌饼,将所有对照组和处理组枝条置于25 ℃恒温条件和每天16 h光照条件下进行保湿培养。2 d后解开封口膜并揭掉脱脂棉,7 d后测量病斑直径。

抑菌直径=接种未拮抗处理组平均菌斑长度-接种拮抗处理组菌斑长度;

拮抗处理组抑菌率=(接种拮抗处理组抑菌直径/接种未拮抗处理组菌斑长度平均值)×100%;

拮抗处理组平均抑菌率=(接种拮抗处理组平均抑菌直径/接种未拮抗处理组平均菌斑长度)×100%。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌的分离纯化和筛选

通过平板稀释法从杨树根际土壤中分离出36株菌株,其中4株对杨树烂皮病菌抑制效果明显,分别命名为X4、SX2、X32、SM1(图1和表1),其中X4对靶标菌抑制效果最好,可达83.96%(图2),用于后续研究。

表1 生防菌对杨树烂皮病菌的抑制效果

图1 4种生防菌株与污黑腐皮壳(Valsasordida Nit)的对峙效果

图2 显微镜下菌株X4对污黑腐皮壳菌的抑制作用

利用光学显微镜观察X4对峙平板菌丝和对照菌落菌丝,发现与生防菌X4对峙的杨树烂皮病菌丝粗细不均匀,菌丝体生长轨迹弯曲并未得到有效延伸,菌丝互相交织、变粗,部分原生质浓缩颜色变深,且菌丝出现连贯变形(图2(B)),而对照菌丝粗细均匀,菌丝体生长轨迹呈直线且并未有原生质浓缩及菌丝变粗现象(图2(A))。

扫描电镜观察与生防菌株X4对峙前沿的杨树烂皮病菌丝,发现处理组菌丝出现变粗、干瘪、皱缩、折叠,原生质外溢及菌丝断裂,而对照菌丝表面光滑,细胞完整,没有原生质外溢现象(图3)。

左：正常菌丝;A.断裂,B.皱缩,C.干瘪、折叠、变粗,D.原生质外溢。

2.2 生防菌株X4的鉴定

X4形态学观察。菌株X4在牛肉膏蛋白胨培养基上生长状态良好,菌落呈不透明乳白色,培养24 h后菌落呈粗糙不透明,污白色或微黄色;培养48 h后菌体表面出现粗糙皱褶,边缘不规则,用接种针挑取时呈黏稠状(图4A)。显微镜观察菌株呈单细胞椭圆到柱状,革兰氏染色呈阳性(图4B)。在NA培养基上菌体呈短杠状或梭状、细胞直径>1.0 μm,芽孢呈椭圆形。

图4 菌株X4在牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落形态(A)和菌体革兰氏染色形态(B)

X4生理生化特性。生防菌株X4的生理生化测定结果显示硝酸还原酶呈阳性、淀粉水解呈阴性、明胶液化呈阳性、甲基红呈阳性、V-P测定呈阳性、柠檬酸盐利用呈阴性、丙酸盐利用呈阴性、蛋白酶活性呈阳性、苯丙氨酸脱氨酶测定呈阴性、吲哚乙酸测定呈阴性、酪氨酸分解测定呈阴性。该菌株在20～40 ℃可稳定生存。

X4菌株的分子生物学鉴定。以细菌基因组DNA为模板,利用16S rDNA基因序列引物经PCR扩增获得约1 200 bp的目的片段(图5),测序获得内生拮抗细菌X4的序列长度为1 176 bp。在NCBI上对测序结果进行BLAST序列分析发现与贝莱斯芽孢杆菌相似,相似率达到99.39%;采用MEGA7软件中的邻接法进行系统发育树构建(图6),发现其与贝莱斯芽孢杆菌聚为一类。综合菌落特征、菌体形态,X4菌株生理生化特征、革兰氏染色反应,16S rDNA鉴定分析,将该菌株鉴定为贝莱斯孢杆菌(Bacillusvelezensis)。

图5 杨树根际土壤拮抗细菌X4菌株16S rDNA的PCR分析

图6 16S rDNA基因序列构建菌株X4系统发育树

2.3 生防菌株X4抑菌谱测定

由表3可知,平板对峙试验中菌株X4对其他6种病原菌均表现出良好的抑制效果,抑菌率均在51.00%以上,其中对松球壳孢的抑制作用最强,抑菌率可达75.00%,对交链格孢的抑制作用最弱,抑菌率为51.19%(图7)。

表3 拮抗菌X4活体对供试病原菌的抑菌谱

1.杨灰星叶点霉;2.松球壳孢;3.立枯丝核菌;4.交链格孢;5.希金斯炭疽菌;6.腐皮镰刀菌;CK.对照。

2.4 生防菌株X4防效测定

采用杨树离体枝条,用烫伤接种法接种污黑腐皮壳菌菌株,测定生防菌株对杨树烂皮病的防治效果,结果表明：生防菌X4拮抗处理后(图8中1、2、3序号枝条)较未拮抗处理组(图8中4、5、6序号枝条)菌斑长度变短、颜色变浅。拮抗后菌斑减少了40.19%以上,平均减少可达46.62%接近50.00%,可见抑制效果十分显著(表4)。

表4 拮抗菌X4活体对供试病原菌的防治效果

CK为未接种未拮抗对照组;1、2、3为接种拮抗处理组;4、5、6为接种未拮抗处理组。

3 讨论与结论

本研究的主要研究对象贝莱斯芽孢杆菌在生物防治中可称为拮抗微生物[25]或称生防菌。生物防治措施通过对植物微生物环境的调节,减少病原体的接种量,减少致病性,抑制病害发生,现多用于土传病害的防治,也用于叶部病害的防治及收后病害的防治。但目前生物防治还存在着生防效果不够稳定,部分生防菌的适用范围较窄;此外因为生防菌存在地理适应性较低的问题,其生产、运输、贮存等条件对生防制剂的要求也比较苛刻,因此比化学防治的防治效益要低,现在也主要作为防治的辅助措施。但在未来随着科技的发展,这些限制条件将逐一淡去,因此生物防治未来可期。而本研究通过平板对峙试验筛选出对发生于枝干部的杨树烂皮病菌具有良好抑制作用的菌株X4即贝莱斯芽孢杆菌也有希望大展身手。

贝莱斯芽孢杆菌所具有的独特的微生态调控作用,即贝莱斯芽孢杆菌菌株能产生一些次生代谢产物,这些次生代谢产物具有明显的抗菌抑菌作用并且能够产生生物膜,具有高效的根部定殖能力,可以有效帮助植物抵御病原微生物的侵染,从而提高植株的抗病性,其已经作为生物肥料和生物防治试剂在农业领域被广泛应用[26],遗憾的是其作为生防菌的大田防效暂未得到验证,也并未得到规模化的生产和应用。

但与贝莱斯芽孢杆菌同属的枯草芽孢杆菌已经在生物防治上有了广泛的应用[27-28],在全国多个省市县的水稻、蔬菜和果树上已经有以枯草芽孢杆菌为主体的微生物杀菌剂的身影存在,与枯草芽孢杆菌相关的杀菌剂与抗病药剂累计推广面积超过400万hm2。增加产值30亿元以上。在要求防治效果达到甚至超过70.0%的条件下,其可有效防治水稻、麦类纹枯病、稻曲病、茄科蔬菜枯萎病、果树轮纹病和黑斑病等多种危害严重的病害。在枯草芽孢杆菌的帮助下,我们获得了更优质的各类农产品,收获了更高的附加价值。贝莱斯芽孢杆菌有望和枯草芽孢杆菌一样帮助人们实现经济社会生态效益的[29]。

本研究以污黑腐皮壳菌为靶标菌从杨树根际分离出一株细菌X4,可有效抑制污黑腐皮壳菌生长,通过细菌形态学、系统发育分析等将菌株X4鉴定为贝莱斯芽孢杆菌,能有效防治杨树烂皮病。通过对于被抑制菌丝光学显微镜和电子显微镜的观察,发现被抑制菌丝出现膨大、皱缩、萎蔫的现象,初步判断为细胞膜系统受损导致内容物溢出,这也是未来进一步对于探究有关生防菌剂对于杨树烂皮病的防治机理的可行方向。经过生防效果测定,该生防菌株对由污黑腐皮壳菌属引起的杨树烂皮病有较为良好的防治效果,病斑长度减少40.19%以上,此外该菌株抑菌谱较广,可抑制除污黑腐皮壳菌外的其他6种植物病原真菌生长,是一种具有广泛应用前景的生物防治菌株。