结核分枝杆菌GroEL2蛋白表达、纯化及生物信息学分析

宋亚敏,魏 婧,郭方正,李柏青,3,许 涛,4#,汪洪涛,3*

(1蚌埠医学院检验医学院检验医学实验中心,蚌埠 233030;2蚌埠医学院慢性疾病免疫学基础与临床安徽省重点实验室;3蚌埠医学院检验医学院免疫学教研室;4蚌埠医学院检验医学院临床检验诊断学教研室;*通讯作者,E-mail：hongtaowang@bbmc.edu.cn;#共同通讯作者,E-mail：taoxu@bbmc.edu.cn)

结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)是引起结核病(tuberculosis,TB)的病原体,是单一传染性病原体致死的主要原因之一。在2019冠状病毒病(COVID-19)影响下,全球TB死亡病例持续增加[1]。尽管对新型TB诊断试剂和疫苗的开发从未中断,但它仍是全球公共卫生的重大负担。

GroEL2属于热休克蛋白(heat shock protein,HSP)家族,是一类典型的伴侣蛋白(chaperone,Cpn)[2,3],其位于GroE操纵子外部的myc28基因上[4]。GroEL2蛋白能够提高细菌的适应能力[5],与Mtb的致病性紧密相关[6],并介导Mtb与巨噬细胞的黏附[7,8],协助细菌进入宿主细胞,在应激刺激下产生增加以保护细胞[9]。虽然GroEL2在Mtb感染过程中十分重要,但对其的研究还未完全明晰。为此,本研究对GroEL2蛋白进行原核表达、纯化和生物信息学分析,为GroEL2在感染中发挥的作用以及作为疫苗候选蛋白、诊断抗原开发的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

pET-28a和MtbH37Ra基因组DNA由慢性疾病免疫学基础与临床安徽省重点实验室保存;大肠杆菌克隆菌株DH5α、表达菌株BL21(DE3)、琼脂糖凝胶回收和质粒提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司;Ni-IDA亲和层析柱购自德国Novagen公司;SDS-PAGE凝胶试剂盒、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜、His-tag小鼠单克隆抗体、HRP标记的山羊抗小鼠IgG购自上海碧云天生物技术有限公司;NcoⅠ和XhoⅠ购自日本TaKaRa公司;ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit和DNA Polymerase购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;ECL化学发光试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司;IPTG购自德国Sigma-Aldrich公司;其余普通试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 GroEL2基因扩增及重组质粒pET-28a-GroEL2的构建 通过https：//www.uniprot.org/uniprot/获取MtbH37Ra的GroEL2基因(MRA_0445)序列,设计引物序列如下：上游引物GroEL2-F：5′-AAGAAGGAGATATACCATGGGCATGGCCAAGACA-ATTGCGTACG-3′(下划线为NcoⅠ酶切位点),下游引物GroEL2-R：5′-TGGTGGTGGTGGTGCTCGAG- GAAATCCATGCCACCCATGTC-3′(下划线为XhoⅠ酶切位点),PCR扩增GroEL2基因。以MtbH37Ra株基因组DNA为模板,用引物对GroEL2-F/GroEL2-R扩增GroEL2基因,反应体系如下：2×Max Buffer 12.5 μl,dNTPs 0.5 μl,DNA Polymerase 0.5 μl,上、下游引物各0.5 μl,模板1 μl,补ddH2O至25 μl。反应条件如下：95 ℃预变性5 min;95 ℃变性15 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸2 min,共35个循环;72 ℃延伸7 min。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收目的基因。

用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切pET28a载体,获得线性pET-28a,然后将GroEL2基因与线性pET-28a同源重组克隆。反应体系如下：线性pET-28a 5.5 μl、GroEL2扩增产物1.5 μl、5×CE Ⅱ Buffer 2 μl、Exnase Ⅱ 1 μl,37 ℃,水浴反应30 min。取重组产物5 μl转化至DH5α中,阳性克隆菌落用T7/T7 ter引物对进行菌落PCR鉴定,将鉴定正确的重组pET-28a-GroEL2载体进行测序鉴定。

1.2.2 GroEL2蛋白的诱导表达、纯化及鉴定 将测序正确的重组pET-28a-GroEL2载体转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),挑取阳性菌落接种至LB(Kan+)液体培养基,37 ℃,振荡培养过夜。次日以1∶100比例扩大培养至100 ml LB(Kan+)液体培养基,当OD600 nm为0.6～0.8时,加入IPTG(终浓度为0.2 mmol/L),37 ℃过夜震荡培养诱导表达。收集菌体离心后加6 ml裂解液(20 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L苯甲酰磺酰氟)超声破碎,离心收集上清及沉淀进行SDS-PAGE电泳分析,电泳样本孔配置：泳道1为pET28a诱导(空载),泳道2为pET-28a-GroEL2未诱导,泳道3为pET-28a-GroEL2诱导后,泳道4为pET-28a-GroEL2诱导破碎后上清,泳道5为pET-28a-GroEL2诱导破碎后沉淀,以此进行表达鉴定。而后将超声破碎后的上清溶液利用Ni-IDA镍亲和层析柱纯化,经Ni-IDA Washing-Buffer(20 mmol/L Tris-HCl,0.5 mol/L NaCl,10 mmol/L咪唑)冲洗后,用Ni-IDA Elution-Buffer(20 mmol/L Tris-HCl,0.5 mol/L NaCl,500 mmol/L咪唑)洗脱目的蛋白。将上述洗脱蛋白溶液放入透析袋中,加入PBS 4 ℃,透析过夜,得到GroEL2纯化蛋白。12% SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度,并湿转至PVDF膜,5%脱脂奶粉室温封闭1 h,经TBST缓冲液洗涤3次后,以小鼠his-tag单克隆抗体为一抗(稀释比例1∶1 000),4 ℃孵育过夜,HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗(稀释比例1∶1 000)室温孵育2 h,经TBST洗涤3次,加入ECL蛋白发光液避光显影进行Western blot鉴定,拍照、分析结果。

1.2.3 GroEL2蛋白的生物信息学分析 从Uniprot获取MRA_0445基因编码的GroEL2蛋白的氨基酸序列(https：//www.uniprot.org/uniprotkb/A5TZG6/entry),将GroEL2蛋白序列与结核分枝杆菌群、麻风分枝杆菌、非结核分枝杆菌、人类热休克蛋白序列进行同源分析(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi);Expasy ProtParam分析GroEL2蛋白的分子质量、稳定系数,亲/疏水性等理化性质(https：//web.expasy.org/protparam/);利用TMHMM server v.2.0分析蛋白跨膜结构(https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/);SignalP 5.0分析信号肽(https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/);PSORT预测该蛋白亚细胞定位(https：//www.psort.org/);采用NetPhos 3.1 Server分析蛋白的磷酸化位点(https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/);NetNGly1.0和NetOGlyc4.0软件分析糖基化位点(https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetNGlyc-1.0/;https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetOGlyc-4.0/);SOPMA和Phyre 2分析二级结构并建立三维模型(https：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html;http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2);String分析蛋白相互作用及GO注释分析其生物学作用(https：//string-db.org),使用GraphPad对GO注释分析进行可视化;ABCpred和SYFPEITHI分析蛋白的B、T细胞抗原表位(http：//crdd.osdd.net/raghava/abcpred;http：//www.syfpeithi.de/)。

2 结果

2.1 GroEL2基因的扩增及重组质粒pET-28a-GroEL2的构建与鉴定

扩增结果显示,GroEL2基因在约1 620 bp处有一条特异性片段,与预期一致(见图1A)。菌落PCR鉴定结果显示,在2 000 bp左右大小位置有特异性条带,与预测相符(见图1B)。测序结果显示,插入基因片段与GroEL2基因序列100%一致(见图1C)。

图1 GroEL2基因扩增及重组质粒pET-28a-GroEL2的鉴定Figure 1 Amplification of GroEL2 gene and identification of recombinant plasmid pET-28a-GroEL2

2.2 GroEL2蛋白的表达

SDS-PAGE电泳分析GroEL2蛋白在感受态细胞中的诱导表达,结果显示GroEL2蛋白主要在上清中表达(见图2)。

图2 GroEL2重组蛋白SDS-PAGE电泳分析 Figure 2 SDS-PAGE electrophoresis of GroEL2 recombinant protein

2.3 GroEL2蛋白的纯化和鉴定

收集超声破碎后离心的上清进行纯化,结果显示在60 kD处有一条清晰单一条带(见图3A),纯度达90%以上;Western blot分析显示,在相对分子质量约60 kD大小位置处可见清晰单一条带(见图3B)。

图3 纯化GroEL2蛋白SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定Figure 3 SDS-PAGE electrophoresis and Western blot identification of purified GroEL2 protein

2.4 GroEL2蛋白的生物信息学分析

2.4.1 同源性分析 BLAST序列对比中E值越小表明可信度越高,Per.Ident则为序列对比的一致性,结果发现目的蛋白与Mtb复合群(包括人型Mtb、牛型Mtb、减毒牛型Mtb等)的同源性为100%,与机会致病分枝杆菌同源性稍有降低,与人类蛋白仅有46.97%的同源性(见表1)。

表1 GroEL2蛋白Blast分析

2.4.2 理化性质及亲/疏水性 Expasy ProtParam软件分析,GroEL2蛋白的分子式C2489H4130N684O804S7,相对分子质量为56 726.69,理论等电点(pI)为4.85,共有540个氨基酸,由19种氨基酸组成(见图4)。不稳定指数为28.87(<40),推测其为稳定性蛋白。亲疏水性分析中正值表示疏水性,负值表示亲水性,总平均亲水性则为序列中所有氨基酸亲水值的总和与氨基酸数量的比值,负值越大表示亲水性越强,正值越大表示疏水性越强。该蛋白总平均亲水性为-0.091,亲水氨基酸明显多于疏水(见图5)。

图4 GroEL2蛋白氨基酸组成及占比Figure 4 Amino acid composition and percentage of GroEL2 protein

图5 GroEL2蛋白亲/疏水性分析Figure 5 Analysis of the hydrophilic/hydrophobicity of the GroEL2 protein

2.4.3 跨膜结构、信号肽和亚细胞定位 利用TMHMM server v.2.0对GroEL2蛋白跨膜结构的分析,显示GroEL2蛋白无跨膜区(见图6)。SignalP 5.0预测该蛋白信号肽结构,根据信号肽酶Ⅰ(Lep)参与切割的分泌信号肽通路、Lep参与切割的双精氨酸转移通路、信号肽酶Ⅱ(Lsp)参与切割的分泌信号肽通路分析,显示GroEL2蛋白无信号肽结构(见图7)。而PSORT分析出该蛋白亚细胞定位,其定位于细胞质概率最高,为60.9%,定位于细胞核和线粒体的概率则为26.1%和13.0%。

2.4.4 翻译后修饰位点 通过NetPhos 3.1 Server对GroEL2蛋白进行磷酸化位点分析,该蛋白可能存在35个磷酸位点,其中磷酸化丝氨酸为15个,磷酸化苏氨酸为15个,磷酸化酪氨酸为5个(见图8)。利用NetNGly软件分析糖基化位点,结果显示其第328和528位氨基酸存在2个O-糖基化潜在位点,得分分别为0.56和0.83(>0.5)。

图8 GroEL2蛋白磷酸化位点分析Figure 8 Analysis of GroEL2 protein phosphorylation sites

2.4.5 蛋白结构 采用SOPMA软件对蛋白二级结构进行分析,其中α螺旋(Hh)结构288个(53.33%),占比最高,无规卷曲(Cc)结构142个(26.30%),延伸链(Ee)结构66个(12.22%),β-转角(Tt)结构44个(8.15%)(见图9)。用SWISS-MODEL进行三级结构建模(见图10),其与模板4v4o.1.A的结构相似性为65.86%,GMQE得分反映了模型预期准确性,得分区间为0～1,分数越高可靠性越高,此建模GMQE指数为0.83,表明建模可信度较高。

图10 GroEL2蛋白三级结构建模Figure 10 Modelling of GroEL2 protein tertiary structure

2.4.6 蛋白相互作用及GO注释分析 String分析显示,GroEL2蛋白与GroEL1、GroES、DnaK、DnaJ1、DnaJ2、HtpG、GrpE、RpoB、HycE、EsxA蛋白存在相互作用(见图11)。GO注释分析该蛋白为ATP依赖性蛋白折叠伴侣,可与未折叠蛋白结合,参与蛋白质的折叠与再折叠(见图12)。

2.4.7 抗原表位 ABCpred通过将目的蛋白分割成固定长度(默认为16个)的氨基酸序列与数据库中的B细胞抗原表位对比,得分区间为0～1,越接近1代表相似度越高,对GroEL2蛋白序列进行预测,研究仅选取分值高于0.8的结果,展示出19个可能形成B细胞抗原表位的区域(见表2)。采用SYFPEITHI软件分析T细胞抗原表位,设定MHC类型为HLA-A*02：01,选取不低于25分的结果,展示11个可能为T细胞抗原表位的氨基酸序列区域(见表3)。

图11 GroEL2相互作用蛋白Figure 11 GroEL2-interacting proteins

图12 GroEL2蛋白GO注释分析Figure 12 GO annotation analysis of GroEL2 protein

3 讨论

WHO报告显示全球TB潜伏感染人群近20亿,因TB死亡的患者是艾滋病毒(human immunodeficiency virus,HIV)相关死亡人数的两倍以上,COVID-19大流行更对结核病诊断和治疗产生破坏性影响[1]。新型TB疫苗尚处于研究阶段,耐多药/广泛耐药TB以及结核病与HIV或非传染性疾病并存,引起治疗持续时间长、治疗效果差的现状使TB治疗面临许多挑战[10,11]。迫切需要在早期快速诊断、改善治疗效果和预防方面进行创新。

GroEL2并不形成Cpn典型的十四聚体双环结构,它在体内和体外都表现为二聚体,这种二聚体形式不仅提供了普遍分子伴侣活性所需的游离顶端结构域,可能还参与Mtb与巨噬细胞的结合[12,13],在宿主低代谢时期(如饥饿、营养不良)Mtb小RNA F6在伴侣蛋白GroEL2和GroES的帮助下,介导病菌在宿主肉芽肿内持久性的生存[14]。另一方面GroEL2蛋白也被证明是有效的T细胞刺激因子,而且其表面暴露的疏水区也可以与肽类抗原相结合,有助于免疫原性肽的呈递,这也可能使它能够扮演双重角色,既作为有效的免疫刺激分子,也可以做免疫原性肽的载体[12,15]。

表2 ABCpred分析GroEL2蛋白B细胞抗原表位

表3 SYFPEITHI分析GroEL2蛋白T细胞抗原表位

本实验将扩增的GroEL2基因克隆至pET-28a载体,成功构建重组pET-28a-GroEL2载体,在大肠杆菌中以可溶性表达,纯化后获得高纯度GroEL2蛋白。生物信息学分析显示,GroEL2蛋白为亲水性、稳定性蛋白,这与原核表达中以可溶性形式存在GroEL2蛋白一致。研究表明,蛋白质磷酸化是蛋白质和细胞功能的关键调节因子,可影响蛋白酶活性、蛋白构象、蛋白相互作用等细胞生命活动过程[16,17]。GroEL2蛋白存在多个磷酸化位点,说明其可能参与调控细胞间的信号转导。蛋白质二级结构预测显示α-螺旋在二级结构中占53.33%,α-螺旋为保守序列,在蛋白模组中起重要作用,表明该蛋白可能具有功能性。不规则卷曲也为蛋白质的重要功能区域,这种结构相对松散,能够进行扭曲、变形,可有效与配体结合,易于抗原表位的形成,该蛋白无规则卷曲含量相对较高,也表明蛋白较容易与抗体嵌合,从而发挥抗原作用[18],不规则卷曲结构的含量相对较高,进一步佐证蛋白可能为重要的功能蛋白。另外B细胞抗原表位多为一类连续排列或间断存在的多肽或多糖在空间上形成特定构象的构象表位,含有B细胞抗原表位的蛋白可以合成多肽,关于构想表位线性疫苗的想法提示,结构不连续但空间相邻的氨基酸所组成的这种线性多肽,同样能够模拟构想表位,替代抗原诱导机体产生B细胞抗体,可用以推动研制疫苗以及免疫诊断的开发[19,20]。在宿主抗结核免疫应答中,T细胞发挥更为重要的功能作用,而T细胞表位含量越高,就越有可能引发免疫反应,故富含T细胞表位的蛋白有可能成为疫苗制备的候选蛋白,T细胞表位多为线性表位,需抗原提呈细胞呈递抗原,该蛋白的二级结构分析展示其以α-螺旋为主,也为T细胞抗原表位的形成提供了可能[21]。本研究预测GroEL2蛋白富含潜在的B细胞抗原表位和T细胞抗原表位,这为该蛋白作为候选疫苗抗原提供条件。

本研究成功对GroEL2蛋白进行了表达纯化及生物信息学分析,为进一步研究该蛋白在结核分枝杆菌病理生理机制提供基础。然而,与以往研究的不足类似,我们并未对可能作为结核病候选疫苗或药物靶点之一的GroEL2进行与免疫细胞的互作实验验证。后续将通过研究GroEL2蛋白对T细胞功能的影响进一步分析其发挥的效用,在纯化出该蛋白后,用组分刺激活动性或潜伏期结核病患的血液,检测血中被刺激的IFN-γ、TNF-α等细胞因子的分泌情况以初步观察GroEL2在体外的抗结核免疫效应,也可以考虑将该蛋白以此规律免疫小鼠后验证其在体内的免疫原性以更好地评估其作为预防或治疗性药物靶标的可能性,以此协助TB防治的发展。另外本研究虽然也对GroEL2蛋白多种生物学功能进行了分析,但是其相关的功能与机制、通路之间的关联性还有待深入挖掘。

综上所述,本研究成功构建重组pET-28a-GroEL2载体,并可在体外进行大量表达和纯化。生物信息学分析展示GroEL2蛋白存在丰富的潜在B、T细胞优势抗原表位,为进一步明确GroEL2蛋白在Mtb感染中发挥的作用提供实验依据,对疫苗新靶点的筛选以及结核病新的诊断方法建立具有重要意义。