冬凌草甲素对骨质疏松大鼠骨折愈合的影响及其机制

成翕悦,李丹丹,崔 如,靖博雅,曹 岩,赵 晶,刘俊川

(1河北医科大学第三医院全科医学科,石家庄 050051;2河北医科大学第三医院友谊院区骨一科;*通讯作者,E-mail：liujunchuansy@163.com)

骨质疏松症是一种以骨微结构破坏和骨质流失为特征的常见骨科疾病[1]。随着骨质量的下降,骨的微观结构被破坏;随着时间的推移,骨骼变得非常脆弱,最终,在最小的外力下就会发生骨折[2]。骨质疏松性骨折康复期长,复发率高,已成为严重的公共卫生问题[3]。治疗骨质疏松性骨折的传统临床方法包括雌激素和双磷酸盐的应用,然而,这两种药物会引起的一些副作用,如骨痂重塑延迟和癌症等[4]。因此,开发高效且副作用小的药物对于骨质疏松性骨折愈合具有重要的意义。冬凌草甲素是一种从冬凌草中提取的四环二萜类化合物,具有抗炎、抗癌等作用[5]。已有研究报道,冬凌草甲素可改善骨质疏松小鼠骨矿物质密度和骨组织形态[6]。但关于冬凌草甲素对骨质疏松性骨折的影响鲜有报道。相关研究显示,激活声波刺猬(sonic hedgehog,Shh)/Gli家族锌指蛋白1(Gli family zinc finger protein 1,Gli1)通路以促进骨形成,抑制骨吸收,可起到防止骨质疏松症的作用[7]。但冬凌草甲素能否通过调控Shh/Gli1信号通路影响骨质疏松大鼠骨折愈合尚不明确。因此,本研究主要探究冬凌草甲素对骨质疏松大鼠骨折愈合的影响以及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

72只7周龄、体质量为200～210 g的SPF级雌性SD大鼠购自上海泰楚生物技术有限公司,许可证号：SCXK(沪)2023-0001。本研究获得本院动物伦理委员会(KSD2023-043-1)的批准,所有动物实验均符合3R原则。

1.2 主要试剂

冬凌草甲素购自武汉远启医药化工有限公司;戊酸雌二醇购自武汉东康源科技有限公司;Shh/Gli1信号通路抑制剂环巴胺购自艾美捷科技有限公司;大鼠肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)ELISA试剂盒购自上海双赢生物科技有限公司;兔源一抗碱性磷酸酶(alkaline phosphatase?,ALP)、Runt相关转录因子2(Runt related transcription factor 2,Runx2)、Shh、Gli1、GAPDH及辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的山羊抗兔二抗均购自英国Abcam公司。

1.3 骨质疏松性骨折大鼠模型的构建

腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉大鼠,俯卧位固定、皮肤消毒后,在背部正中行纵切口,分离并切除后腹膜外双侧卵巢,缝合切口。通过检测骨密度筛选骨质疏松大鼠。骨质疏松大鼠造模成功率为100%。术后1周后进行右侧股骨干骨折髓内固定术,简言之,麻醉大鼠,在大鼠右大腿外侧行纵行切口,分离并锯断股骨中段,将克氏针固定在髓腔内,缝合伤口,以构建骨质疏松性骨折大鼠模型[8]。

1.4 动物分组及给药

按照随机数字表法将72只大鼠随机分为对照组、模型组、冬凌草甲素低剂量组、冬凌草甲素高剂量组、戊酸雌二醇组、冬凌草甲素高剂量+环巴胺组,每组12只。对照组大鼠仅切除卵巢周围部分脂肪组织,不切除双侧卵巢,术后1周后行右侧股骨干骨折髓内固定术。其余各组大鼠均采用双侧卵巢切除术联合右侧股骨干骨折髓内固定术的方法构建骨质疏松性骨折大鼠模型。建模成功24 h后,进行给药处理,冬凌草甲素低剂量组、冬凌草甲素高剂量组、戊酸雌二醇组大鼠分别需灌胃2.2 mg/kg冬凌草甲素、6.66 mg/kg冬凌草甲素[9]、9 mg/kg戊酸雌二醇[10],且均需腹腔注射等体积的生理盐水;冬凌草甲素高剂量+环巴胺组大鼠需灌胃6.66 mg/kg冬凌草甲素且还需腹腔注射3.33 mg/kg环巴胺[11];对照组、模型组大鼠均需灌胃且腹腔注射等量的生理盐水,给药1次/d,持续4周。

1.5 标本收集

末次处理24 h后,每组选取全部大鼠,2%戊巴比妥钠麻醉所有大鼠以进行X射线检测评估大鼠骨折愈合情况;然后收集大鼠的腹主动脉血经离心得血清用于ELISA实验;血液收集完成后,处死大鼠,分离并收集大鼠完整的右股骨,分为两部分,每部分包含6只大鼠的股骨,一部分用于三点弯曲实验,三点弯曲实验结束后,取股骨骨痂组织冻存于-80 ℃用于Western blot实验;另一部分用于双能X线骨密度扫描仪检测,骨密度检测结束后,截取股骨骨痂组织用于HE-阿尔新蓝染色。

1.6 X射线检测评估大鼠骨折愈合

利用X射线照射大鼠右侧股骨骨折处以评估大鼠骨折愈合情况。

1.7 ELISA法检测大鼠血清中TNF-α、IL-6水平

严格按照ELISA试剂盒说明书检测大鼠血清中TNF-α、IL-6水平。

1.8 三点弯曲实验检测大鼠股骨最大载荷、最大位移

固定大鼠完整的右股骨,使用力学测试装置进行三点弯曲实验[12],参数设置为：支点跨距20 mm,加载速度2 mm/min,施加压力直至骨头断裂,最后通过计算机计算最大载荷、最大位移。

1.9 双能X线骨密度扫描仪检测大鼠股骨骨密度

利用双能X线骨密度扫描仪检测大鼠股骨骨密度。

1.10 HE染色检测大鼠骨痂组织病理变化

截取股骨骨痂组织,浸入20%乙二胺四乙酸溶液中进行脱钙处理。将脱钙样品包埋在石蜡中,切成厚度为5 μm的切片,并用HE-阿尔新蓝染色。使用光学显微镜对股骨骨痂组织的染色切片进行组织学评估。

1.11 Western blot检测大鼠骨痂组织中ALP、Runx2、Shh、Gli1蛋白表达

利用RIPA裂解缓冲液提取大鼠骨痂组织总蛋白。将蛋白进行定量、电泳、转膜、封闭后,将膜与一抗ALP(1∶4 000)、Runx2(1∶4 000)、Shh(1∶3 000)、Gli1(1∶3 000)、GAPDH(1∶3 000)在4 ℃下孵育过夜。再将膜与二抗(1∶2 000)共同孵育1 h。加入ECL试剂可视化蛋白,利用Image J软件评估目的蛋白灰度值。

1.12 统计学分析

2 结果

2.1 冬凌草甲素对大鼠骨折愈合的影响

对照组大鼠骨折端有连续性骨痂生长,骨折线消失;模型组大鼠骨折端未见骨痂生长,骨折线清晰可见;与模型组比较,冬凌草甲素低剂量组、冬凌草甲素高剂量组、戊酸雌二醇组大鼠骨折端可见骨痂生长,骨折线模糊不清;与冬凌草甲素高剂量组比较,冬凌草甲素高剂量+环巴胺组大鼠骨折端骨痂生长较少,骨折线较清晰(见图1)。

图1 大鼠股骨骨折X线表现Figure 1 X-ray of femoral fracture in rats

2.2 冬凌草甲素对大鼠血清中TNF-α和IL-6水平变化的影响

与对照组比较,模型组大鼠血清中TNF-α和IL-6水平升高(P<0.05);与模型组比较,冬凌草甲素低剂量组、冬凌草甲素高剂量组和戊酸雌二醇组大鼠血清中TNF-α和IL-6水平降低(P<0.05);冬凌草甲素高剂量组和戊酸雌二醇组大鼠血清中TNF-α和IL-6水平变化差异无统计学意义(P>0.05);与冬凌草甲素高剂量组比较,冬凌草甲素高剂量+环巴胺组大鼠血清中TNF-α和IL-6水平升高(P<0.05,见表1)。

表1 各组大鼠血清中TNF-α和IL-6水平变化比较n=12,ng/L)

2.3 冬凌草甲素对大鼠股骨最大载荷和最大位移的影响

与对照组比较,模型组大鼠股骨最大载荷和最大位移降低(P<0.05);与模型组比较,冬凌草甲素低剂量组、冬凌草甲素高剂量组和戊酸雌二醇组大鼠股骨最大载荷和最大位移升高(P<0.05);冬凌草甲素高剂量组与戊酸雌二醇组大鼠股骨最大载荷和最大位移变化差异无统计学意义(P>0.05);与冬凌草甲素高剂量组比较,冬凌草甲素高剂量+环巴胺组大鼠股骨最大载荷和最大位移降低(P<0.05,见表2)。

表2 各组大鼠股骨最大载荷和最大位移变化比较n=6)

2.4 冬凌草甲素对大鼠股骨骨密度的影响

与对照组比较,模型组大鼠股骨的骨密度降低(P<0.05);与模型组比较,冬凌草甲素低剂量组、冬凌草甲素高剂量组和戊酸雌二醇组大鼠股骨的骨密度升高(P<0.05);冬凌草甲素高剂量组与戊酸雌二醇组大鼠股骨骨密度的变化差异无统计学意义(P>0.05);与冬凌草甲素高剂量组比较,冬凌草甲素高剂量+环巴胺组大鼠股骨的骨密度降低(P<0.05,见表3)。

表3 各组大鼠股骨的骨密度变化比较

2.5 冬凌草甲素对大鼠骨痂组织病理变化的影响

对照组大鼠骨小梁排列整齐,结构完整;模型组大鼠骨小梁结构紊乱,间隙大,数量少且形态较细,血肿尚未完全机化;与模型组比较,冬凌草甲素低剂量组、冬凌草甲素高剂量组和戊酸雌二醇组大鼠骨小梁排列较密集,间隙小,数量多且较粗;与冬凌草甲素高剂量组比较,冬凌草甲素高剂量+环巴胺组大鼠骨小梁变细,结构疏松(见图2)。

蓝色为血肿部分;黑色箭头指示为骨小梁图2 HE-阿尔新蓝染色检测大鼠骨痂组织病理变化 (×200)Figure 2 Pathological changes of rat callus by HE-Alcianblue staining (×200)

2.6 冬凌草甲素对大鼠骨痂组织中成骨关键蛋白及Shh/Gli1信号通路相关蛋白表达的影响

与对照组比较,模型组大鼠骨痂组织中ALP、Runx2、Shh和Gli1蛋白表达降低(P<0.05);与模型组比较,冬凌草甲素低剂量组、冬凌草甲素高剂量组和戊酸雌二醇组大鼠骨痂组织中ALP、Runx2、Shh和Gli1蛋白表达升高(P<0.05);冬凌草甲素高剂量组与戊酸雌二醇组hesi大鼠骨痂组织中ALP、Runx2、Shh和Gli1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);与冬凌草甲素高剂量组比较,冬凌草甲素高剂量+环巴胺组大鼠骨痂组织中ALP、Runx2、Shh和Gli1蛋白表达降低(P<0.05,见图3和表4)。

图3 Western blot检测各组大鼠骨痂组织中ALP、Runx2、Shh、Gli1蛋白表达Figure 3 Expressions of ALP, Runx2, Shh and Gli1 proteins in callus tissue of rats in each group by Western blot

表4 各组大鼠骨痂组织中ALP、Runx2、Shh、Gli1蛋白表达比较

3 讨论

骨质疏松性骨折是骨质疏松症最严重的并发症,其发病率和死亡率高,严重影响中老年人的健康和生活质量[13]。骨折愈合是一个复杂的动态过程,主要受力学稳定性和骨折区周围微环境的影响[14]。骨折部位的局部骨折微环境富含多种细胞、细胞因子和生长因子,这是骨和软组织修复所必需的[15]。当骨折微环境的内稳态被破坏时,如TNF-α和IL-6过度积累引起的炎症反应,可导致骨折愈合延迟甚至骨不愈合[16,17]。因此,通过抑制TNF-α和IL-6来缓解炎症反应对于骨折愈合至关重要。在本项研究中,首先采用双侧卵巢切除术联合右侧股骨干骨折髓内固定术的方法构建骨质疏松性骨折大鼠模型,结果显示,与对照组比较,模型组大鼠股骨最大载荷、最大位移、骨密度降低,骨小梁结构紊乱,间隙大,数量少且形态较细,骨折端未见骨痂生长,骨折线清晰可见,符合骨质疏松性骨折的病理特征。此外,本研究还发现,与对照组比较,模型组大鼠血清中TNF-α和IL-6水平升高,表明炎症反应参与了大鼠骨质疏松性骨折过程。另有研究表明,ALP是成骨细胞成熟的标志物,其在骨折中呈下调表达[18];Runx2作为早期成骨细胞转录因子,其突变会诱导骨骼发育异常[19]。因此,本研究检测了骨痂组织中成骨相关蛋白ALP、Runx2的表达,结果显示,与对照组比较,模型组大鼠骨痂组织中ALP、Runx2蛋白表达降低,表明骨质疏松性骨折大鼠骨生长受到抑制。因此,减轻炎症反应、促进骨生长可能成为改善骨质疏松性骨折的有效策略之一。

冬凌草甲素是东亚草药中常用的二萜类天然产物,因其具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、预防肝纤维化等广泛的生物活性,正日益受到生物医学界的关注[20]。据报道,冬凌草甲素可改善小鼠炎症诱导的骨质流失[9];冬凌草甲素可在体外水平上促进成骨细胞分化[21];冬凌草甲素能够有效降低糖皮质激素诱导的大鼠股骨颈骨折风险[22]。本研究结果与其是一致的,本研究显示,冬凌草甲素可增加骨质疏松性骨折大鼠骨密度,减轻炎症反应,促进骨生长,进而促进骨折愈合,且冬凌草甲素剂量越高,骨折愈合能力越强。另有研究报道,戊酸雌二醇是临床上常用于治疗骨质疏松性骨折的常用药物[23],本研究以该药物为阳性药物,结果显示,高剂量冬凌草甲素与戊酸雌二醇对骨质疏松大鼠骨折愈合的促进作用差异无统计学意义,提示冬凌草甲素可能成为治疗骨质疏松性骨折的潜在有效药物之一。

Shh/Gli1信号通路可调节胚胎发育的所有阶段以及许多组织和器官的产生,该通路的激活可促进骨形成[24]。已有研究报道,激活Shh/Gli1信号通路可改善糖皮质性骨质疏松模型大鼠成骨[25]。本研究显示,与对照组比较,模型组大鼠骨痂组织中Shh、Gli1蛋白表达降低,大鼠骨质疏松性骨折严重,表明Shh/Gli1信号通路的抑制参与了大鼠骨质疏松性骨折过程。此外,本研究还发现,冬凌草甲素可上调骨质疏松性骨折大鼠骨痂组织中Shh、Gli1蛋白表达,且冬凌草甲素剂量越高,上调作用越明显,推测冬凌草甲素可能通过激活Shh/Gli1信号通路促进骨质疏松大鼠骨折愈合。为了验证该推测,本研究在高剂量冬凌草甲素作用的基础上再加上Shh/Gli1信号通路抑制剂环巴胺来干预骨质疏松性骨折大鼠,结果显示,环巴胺减弱了高剂量冬凌草甲素对骨质疏松大鼠骨折愈合的促进作用。证实了猜想的正确性,即冬凌草甲素可能通过激活Shh/Gli1信号通路促进骨质疏松大鼠骨折愈合。此外,有研究显示,Shh/Gli1信号通路的上调可促进二甲双胍诱导的人牙周韧带干细胞成骨,表现为ALP、Runx2表达升高[26];Shh/Gli1信号通路可通过调控TNF-α、IL-6等炎性因子的表达抑制烟雾诱导小鼠的气道炎症反应[27]。表明Shh/Gli1信号通路可通过调控ALP、Runx2、TNF-α、IL-6表达影响成骨及炎症反应。结合本研究结果,提示冬凌草甲素可能通过激活Shh/Gli1信号通路下调TNF-α和IL-6表达抑制炎症,上调ALP和Runx2表达促进成骨,进而促进骨质疏松大鼠骨折愈合。

综上所述,冬凌草甲素可能通过激活Shh/Gli1信号通路促进骨质疏松大鼠骨折愈合。冬凌草甲素促进骨质疏松大鼠骨折愈合的机制较为复杂,具体通过Shh/Gli1信号通路下游的哪些蛋白来发挥作用有待后续实验进一步探究。