维生素E对脊尾白虾生长及抗氧化酶活性的影响*

李婉莹,于淼淼,彭豫鹏,牟 华,c,2,高 焕,c,2,阎斌伦,c,2

(1.江苏海洋大学 a.海洋科学与水产学院; b.江苏省海洋生物技术重点实验室; c.江苏省海洋生物产业技术协同创新中心,江苏 连云港 222005; 2.江苏省农业种质资源保护与利用平台,江苏 南京 210014)

0 引言

脊尾白虾(Exopalaemoncarinicauda)属于甲壳动物,体长为5～9 cm,体色透明,是我国特有的经济养殖品种。脊尾白虾一般生活在泥沙底质的浅海海域,在我国的渤海、黄海、东海和南海等区域的近海区域都有分布[1]。该虾环境适应力强,具有广温和广盐的特性,在水温2～38 ℃,盐度4～35范围内均能存活,同时生长周期短,2～3个月即可长到成体,所制成的海产品美味且营养丰富,深受消费者欢迎,已经成为重要的经济水产动物之一[2]。

维生素是动物体内维持生命所需的一类有机化合物。目前已知的维生素种类很多,如维生素A、维生素B1、维生素C、维生素E等。其中维生素E又称为生育酚,能有效防止体内红细胞和细胞膜的氧化,但其在动物体内不能自主合成,动物只能通过外界摄入来获取[3]。在水产动物营养生理研究方面,维生素E对水产动物的生长性能和抗氧化能力影响情况一直备受研究者的关注,维生素E也是甲壳类动物维持生殖和生理活动必需的营养素[4]。例如在饲料里添加适量的维生素E可以显著提高罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)的抗氧化能力[5]。作为重要经济养殖对虾的脊尾白虾,目前关于其人工配制饲料中应该添加的最适维生素E量还未见报道,这不利于脊尾白虾大规模人工养殖活动的开展。因此本文希望通过对不同维生素E添加水平对脊尾白虾生长和抗氧化能力影响的研究,来为精准研制脊尾白虾人工饲料提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验用脊尾白虾为健康个体,用电子天平称量各组虾平均体质量为(1.31±0.31)g。维生素E添加剂、超氧化物歧化酶(SOD)(批号20230103)、过氧化氢酶(CAT)(批号20230103)、过氧化物酶(POD)(批号20221115)测定所用试剂盒由南京建成生物公司生产。

1.2 实验方法

1.2.1 实验设计 选取大小均匀、体格健壮、活力强的脊尾白虾450尾,分成5组,每组设置3个平行,每个重复30尾,放入水箱(50 cm×40 cm×30 cm)进行养殖,维生素E添加剂按0 mg/kg(A组,对照)、200 mg/kg(B组)、400 mg/kg(C组)、800 mg/kg(D组)、1 600 mg/kg(E组)加入到配制的基础饲料中进行投喂。脊尾白虾基础饲料配方和成分含量如表1所示。

1.2.2 实验饲料制备 根据表1,参考王玉等[6]的方法准备材料,用筛子筛过后,于盆中加入各种材料并搅拌混匀,随后再加入鱼油搅拌混匀;混匀之后开始一边搅拌一边加入清水,进一步混匀后用挤压机挤压成1.0 mm大小的颗粒。挤压出来的饲料放置于烘干箱中50 ℃烘干3～4 h,烘干完毕后取出进行含水量检测,当含水量低于10%时即可封装于袋中,现做现用。

1.2.3 养殖管理 在江苏省海洋生物技术重点实验室进行养殖实验,自然采光,全天24 h充氧,盐度为25,水温为25 ℃,在全天曝气的养殖环境中暂养一周。实验前将脊尾白虾饥饿24 h。每天投喂2次,投喂量为虾体质量的3%,期间及时清理养殖环境里的残饵和粪便并换水。

1.2.4 样品采集 饲养结束后,饥饿脊尾白虾24 h,测定虾的体质量,每箱随机取样3尾,称取肝胰腺质量;在样品中按质量比1∶10的比例加入生理盐水,冷冻匀浆,转速为2 500 r/min,离心10 min,取上清液,弃沉淀,上清液于-80 ℃冰箱里保存。

1.3 指标测定

1.3.1 生长指标测定 养殖实验结束后,计算各组脊尾白虾的生长指标:增质量率(WGR)和特定生长率(SGR)。计算公式分别为

增质量率(%)=(实验结束时脊尾白虾的平均体质量-实验初始脊尾白虾的平均体质量)/实验初始脊尾白虾的平均体质量×100%,

特定生长率(%/d)=(ln(实验结束时脊尾白虾的平均体质量)-ln(实验初始脊尾白虾的平均体质量))/t×100%。

1.3.2 肝胰腺组织蛋白浓度测定 酶活测定前需要先测定脊尾白虾肝胰腺组织蛋白浓度,蛋白浓度测定步骤如下。

(1) 首先配制标准液质量浓度为25 mg/mL,保存备用。

(2) 接着吸取标准液到96孔板里,加入适量生理盐水,稀释为等梯度的标准品(0,0.025,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mg/mL)。

(3) 然后用移液枪吸取200 μL的BCA工作液(V(A液)∶V(B液)=50∶1)到每个微孔里,在37 ℃恒温培养箱里静置30 min。

(4) 利用标准品绘制标准曲线(见图1)。

1.3.3 肝胰腺组织抗氧化指标测定 取组织上清液用试剂盒进行酶活测定,步骤如表2～表4所示。

表2 ACP活力测定操作Table 2 ACP activity determination operation μL

表3 AKP活力测定操作Table 3 AKP activity determination operation μL

表4 SOD活力测定操作Table 4 SOD activity determination operation μL

(1) 孵育。将准备好的样品逐一添加至96孔板中,在适当温度下孵育一段时间。

(2) 读取结果。使用酶标仪读取每个孔的颜色强度,颜色强度与组织中酶活性成正比。

(3) 数据分析。根据已知浓度标准曲线,计算样本中抗氧化酶活性。

1.4 数据统计与分析

使用软件SPSS进行差异显著性分析,P<0.05表示存在显著性差异。

2 结果

2.1 饲料维生素E对脊尾白虾生长的影响

脊尾白虾的生长指标变化情况如表5所示。可以看出,生长指标随着维生素E的水平增加而逐渐增加,脊尾白虾增质量率和特定生长率呈现先上升后下降趋势;其中在维生素E添加量为400 mg/kg时,虾的增质量率和特定生长率最高,超过此质量分数则呈现下降趋势。

表5 饲料中维生素E水平对脊尾白虾生长的影响(平均差±标准差)Table 5 Effect of vitamin E level in feed on the growth of Exopalaemon carinicauda (Mean±SD)

2.2 饲料维生素E对脊尾白虾抗氧化酶活性的影响

本实验通过对各组脊尾白虾肌肉中抗氧化酶的活性来反应脊尾白虾的抗氧化指标情况。具体影响如表6所示,随着维生素E水平的增加,脊尾白虾肌肉中SOD酶活性呈现先上升后下降趋势;在添加量为400 mg/kg时SOD酶活性最高,超过此质量分数则呈现下降趋势。各组间CAT和POD酶活性并没有显著性差异。

表6 饲料中添加维生素E水平对脊尾白虾抗氧化酶活性的影响(平均值±标准差)Table 6 Effect of vitamin E level in feed on antioxidant enzyme activity of Exopalaemon carinicauda (Mean±SD)

3 讨论

3.1 饲料维生素E对脊尾白虾生长的影响

维生素E可以防止DNA结构变异,促进酶的合成和抑制活性氧(ROS)反应,保证机体各项生理活动正常运行,具有促进生长发育的功能[7]。单凡等[8]研究表明,饲料中维生素E添加量为103.4～631.7 mg/kg组的罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)增质量率(WGR)和特定生长率(SGR)显著增加。孔有琴等[9]研究表明,随着饲料中维生素E添加量增加,日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)的WGR呈先升高后下降的趋势。这与本研究结果相似,与对照组相比,当维生素E添加量为200～400 mg/kg时脊尾白虾的WGR和SGR增加,添加量为400 mg/kg时达到最高,但添加量为600～800 mg/kg时呈下降趋势,并在800 mg/kg时显著低于对照组。说明饲料中添加维生素E量太高反而会破坏虾体内环境稳定,增加虾体内代谢负担,从而抑制虾的生长发育活动[10]。

3.2 饲料维生素E对脊尾白虾抗氧化酶活性的影响

由于没有成对的电子,所以ROS化学活性很强,主要包括O2-,O3和H2O2等,ROS为机体免疫系统的重要组成部分,通过氧化攻击病原体,达到保护机体的目的[11]。通常,在机体抗氧化酶作用下,过多的ROS可以通过化学反应等方式降低氧化作用,避免其无差别攻击体内细胞[12],但一旦产生过多自由基,会导致细胞加速衰老并且产生病变[13]。在正常的生理状态下,机体代谢产生的活性氧可被抗氧化系统控制得以及时清除[14];抗氧化酶可防止细胞组织被氧化损坏[15]。

本次实验通过提取脊尾白虾的肝胰腺组织来测定抗氧化酶的酶活。结果表明,维生素E水平为200～400 mg/kg时,脊尾白虾SOD活性随着维生素E水平升高而升高,且在400 mg/kg时活性最高,超过这个水平范围便呈现下降趋势。这说明维生素E水平过高,可能会增加脊尾白虾肝胰腺代谢的负担,导致SOD酶活力下降[16]。已有研究表明,各组日本沼虾肝胰腺的SOD酶活力随饲料维生素E水平的增加呈先上升后下降的变化趋势[10];陈文燕[17]研究发现杂交鳢(Channaargus×Channamaculata)的SOD活性随维生素E水平的增加呈先升高后降低的趋势,这与本文实验结果相似。但本实验中虾肌肉中CAT和POD活性并没有随着维生素E添加量增加而发生显著性变化。王海燕[18]研究中发现,在饲料中添加不同水平维生素E的幼蛙肝脏的CAT活力差异不显著;Wang等[19]研究发现,在黄菇鱼(Nibeaalbiflora)饲料中添加维生素E对于CAT活性无影响,但是使SOD活性显著增加。孔有琴等[9]发现日本沼虾CAT活性随着饲料中维生素E水平的升高而下降,原因可能是维生素E作为一种抗氧化剂,可代替多种抗氧化酶来保护机体免受氧化损害。所以在本实验中脊尾白虾肌肉中CAT和POD酶活性没有随着维生素E的添加而增加,并不能代表饲料中添加维生素E没有提高脊尾白虾抗氧化能力。

4 结论

本实验通过在饲料中添加不同水平维生素E,来探究维生素E水平对脊尾白虾生长性能和抗氧化酶活性的影响。结果显示,与对照组相比,饲料维生素E水平在400 mg/kg时,脊尾白虾增质量率、特定生长率和SOD酶活性最高。