GEO芯片分析联合网络药理学探讨青风藤治疗特发性膜性肾病的作用机制

江宜宏,郑佳新

(黑龙江省中医药科学院,黑龙江 哈尔滨 150036)

膜性肾病是成人肾小球肾炎的一种常见类型,根据病因分为特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy,IMN)和继发性膜性肾病(secondary membranous nephropathy,SMN),其中75%表现为IMN,SMN多由临床疾病发展而来[1]。IMN具有病程反复、迁延难愈的特点,约80%的IMN患者临床表现为肾病综合征[2],目前临床治疗上主要依赖于激素、免疫抑制剂、ACEI和ARB类等药物[3]。然而,长期的西药治疗不仅给患者家庭带来巨大的经济负担,而且治疗后仍存在复发的可能,甚至伴随着严重的副作用。

中药青风藤最早被用于治疗类风湿性关节炎,大量研究证实青风藤具有抗炎、镇静、镇痛作用,对非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫均有抑制作用[4-5]。近年来,青风藤及其复方不断被应用在治疗膜性肾病等肾脏疾病上,临床上取得了显著疗效,但其具体作用机制尚未明确。本研究利用基因表达综合数据库(gene expression omnibus,GEO)对IMN相关差异表达基因进行分析,同时借助网络药理学探讨青风藤治疗IMN的关键靶点及相关通路,为进一步研究青风藤治疗IMN提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 数据库及数据处理工具 本研究所用数据库包括TCMSP、GEO、Uniprot、STRING、DAVID 6.8、KEGG、PDB,数据处理工具包括Venny 2.1.0 在线平台、Cytoscape 3.9.0软件、Origin Lab 2020软件、Auto Dock1.5.7软件、Pymol软件、Open Babel软件。

1.2 青风藤活性成分及对应靶点 在 TCMSP数据库中输入青风藤,设置条件为口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和类药性(drug like,DL)≥0.18,筛选出符合条件的青风藤活性成分及其对应的蛋白质靶点,并根据已发表的文献报道补充未预测到的活性化合物的已知靶点。筛选结束后,为规范青风藤活性成分及对应蛋白质靶点,借助Uniprot数据库(https://www.Unipmt.org)进行匹配规范。

1.3 青风藤“活性成分-靶点”网络的构建 将筛选到的青风藤成分和靶点导入Cytoscape软件,构建青风藤“活性成分-靶点”可视化网络,利用cytoNCA插件分析有效成分及靶点的网络拓扑参数,包括Dgeree、Betweenness等,并根据网络拓扑学参数判断核心靶点和发挥药效的主要活性成分。

1.4 IMN差异表达基因筛选 基因数据来源于GEO数据库中的GSE115857芯片。该芯片数据包含7例健康活体捐赠者和11例IMN患者的肾脏组织基因表达量,以P<0.05且|log FC|≥1为条件筛选差异表达基因。

1.5 靶点蛋白质相互作用网络(PPI)构建 利用在线平台Venny 2.1.0将青风藤药物靶点与IMN靶点匹配取交集并绘制韦恩图,采用STRING数据库(http://string-db.org/)对获得的交集靶点之间的相互作用进行分析,物种设置为“Home sapiens”,最小相互作用阈值设定为0.4,隐藏离散靶点,其他参数保留默认值,得到PPI网络,并通过Cytos Scape 3.9.0中的MCODE插件对PPI网络进一步分析,以degree值大小设置节点大小及颜色,分析其主要靶点基因。

1.6 GO靶点功能注释和KEGG通路富集分析 使用DAVID数据库对青风藤治疗IMN的靶点进行基因生物学富集分析(gene ontology,GO)和基因组通路富集分析(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG),设置阈值P<0.05,保存数据结果并借助Origin Lab 2020对数据进行可视化。

1.7 分子对接验证活性成分-关键靶点 根据上述分析结果,从TCMID数据库下载青风藤活性成分的SDF格式文件,经Open Babel软件转化为MOL 2格式文件。使用PDB数据库筛选获取青风藤核心靶点的3D结构,然后将文件导入Py Mol软件中进行去水、加氢、删除配体等处理,设置分子对接的活性口袋,利用Auto Dock Vina 软件将受体(靶点)与配体(活性成分)进行半柔性对接,预测两者的结合性能,从而验证本研究结果的准确性,并利用Py Mol软件绘制对接结果图。

2 结果

2.1 青风藤活性成分和靶点的获取 初步提取青风藤化学成分16种,经过筛选后获得6种活性成分,见表1。根据青风藤活性成分,经过去重和排除非人类靶点蛋白后,共得到52个靶点,并获得其相应标准基因名。

表1 青风藤主要活性成分Table 1 The main active ingredient of Caulis Sinomenii

2.2 青风藤 “活性成分-靶点”网络的构建 将筛选出的靶点导入Cytoscape软件3.9.0,构建青风藤“活性成分-靶点”网络,见图1。该网络包含了59个节点和112条边,其中矩形、菱形和圆形分别代表青风藤、活性成分和对应靶点蛋白。根据degree值排名前4位的分别是β-谷甾醇(beta-sitosterol)、左旋千金藤啶碱(stepholidine)、拉兹马宁碱(16-epi-Isositsirikine)和青藤碱(sinomenine),可能是青风藤起治疗作用的主要成分。

图1 青风藤“活性成分-靶点”网络图Figure 1 “Active ingredient-arget” network diagram of Caulis Sinomenii

2.3 IMN差异表达基因的获取 以P<0.05且|log FC| ≥1为标准对GEC115857芯片数据进行整理和分析,得到差异表达基因共3 983个。

2.4 核心靶点及靶点PPI网络分析 将青风藤活性成分靶点和IMN差异表达基因取交集得到青风藤-IMN共同靶点8个,见图2。对共同靶点构建PPI网络,并运用Cytoscape软件对PPI网络进一步分析,见图3。此网络中包含13个节点和31条边,图中节点大小代表该靶点作用强度,degree 值越高,节点越大,对应颜色越深,其相关靶标蛋白重要性排名见表2。说明青风藤治疗IMN作用机制复杂,非单一蛋白靶标作用而成。

图2 青风藤活性成分-IMN靶点Venn图Figure 2 Venn diagram of active ingredient of Caulis Sinomenii and IMN

图3 青风藤-IMN核心靶点互作网络Figure 3 Core target interoperability network of Caulis Sinomenii and IMN

表2 青风藤治疗IMN关键靶点Table 2 Caulis Sinomenii treatment of IMN key targets

2.5 靶点功能与通路的分析 应用DAVID数据平台对青风藤治疗IMN相关靶点进行信号通路分析,并对数据进行可视化处理。由结果可见多个靶点参与了细胞凋亡过程,见图4;参与的通路主要有MAPK通路、cAMP通路和癌症相关通路等,见图5。

注:BP.生物学过程(biological process);CC.细胞定位(cellular component);MF.分子功能(molecular function)。图4 青风藤治疗IMN的GO分析图Figure 4 GO analysis of the treatment of IMN by Caulis Sinomenii

2.6 分子对接结果 选择青风藤活性成分和PPI网络中degree前5的核心靶点进行分子对接,结果见表3。根据对接得分判断青风藤活性成分与核心靶点的结合性能,结合能≤ -5.0 kJ/mol说明活性成分与靶点对接效果较好。对接结果显示,药效成分与核心靶点的最低结合能均小于0 kJ/mol,说明受体与配体间可以自发结合,其中JUN蛋白与各成分的对接结合能均小于-5.0 kJ/mol,CASP3蛋白、CASP8蛋白、EP300蛋白、和RIPK1蛋白与β-谷甾醇、甘露聚糖、乌心石环氧内酯的对接结合能均小于-5.0 kJ/mol 。对对接结果进行可视化,结果见图6。

3 讨论

IMN 是Th2 介导的体液免疫所致,导致以IgG4 为主的原位免疫复合物在GBM上皮细胞侧形成,并激活补体,导致膜攻击复合物(C5b-9)刺激足细胞释放炎症介质引起蛋白尿和GBM损伤[6],不少学者认为IMN应属一种自身免疫性疾病。青风藤味苦、辛,性味平,归肝、脾经,具有祛风湿、通经络、利小便的功效,常作为主要药物出现在IMN的中药治疗中,在改善肾功能、减轻蛋白尿方面疗效肯定[7]。

本研究筛选出青风藤的有效成分6个,其主要活性成分包括β-谷甾醇、左旋千金藤啶碱、青藤碱和拉兹马宁碱。β-谷甾醇是植物甾醇的重要组成成分,通过上调γ-干扰素和下调白介素-6、肿瘤坏死因子-α发挥抗炎作用[8]。青藤碱可通过调控足细胞自噬相关的信号通路,引起应激性的细胞自噬,对肾脏发挥保护作用[9]。左旋千金藤啶碱主要作用于多巴胺受体[10]。拉兹马宁碱相关研究文献较少,主要涉及肿瘤抑制方面的作用。青风藤的主要成分对于机体炎症及细胞凋亡均有相应作用。

进一步对青风藤与IMN的共同靶点进行分析研究,结果显示青风藤对IMN起治疗作用的主要靶点为JUN、CASP3、CASP8、EP300。JUN是一种转录因子,主要调控炎症因子和金属蛋白酶(MMPs)[11],参与细胞增殖、分化、凋亡,影响机体的免疫和炎性反应[12]。CASP3是青风藤治疗IMN的一个重要靶点,CASP3被认为是即将死亡或因细胞凋亡而死亡的细胞的可靠标记,通过对细胞凋亡过程中的大部分蛋白水解参与细胞凋亡途径[13]。此外对CASP3缺陷小鼠的研究发现,小鼠肾脏显示增殖性肾小球病变,系膜区域出现 IgA 和补体3的免疫复合物沉积,足细胞损伤和肾小管间质中存在炎性细胞浸润,提示CASP3可能在膜性肾病的发病机制中具有双重调节作用[14]。CASP8是细胞凋亡的分子开关,可抑制 RIPK3和 MLKL介导的坏死性凋亡,药物可通过抑制CASP8的活性降低RIPK3和MLKL水平阻断坏死性凋亡[15]。EP300作为相互作用分化抑制因子主要在癌症中表达,EP300突变上调了参与免疫系统的信号通路,其可能通过增强自身抗免疫能力起到治疗IMN的作用[16]。这表明青风藤介导的主要靶点可通过调控人体免疫系统,减少肾小球基底膜免疫复合物沉积,抑制炎症因子释放等起到治疗IMN的作用。分子对接验证结果亦表明β-谷甾醇、左旋千金藤啶碱、青藤碱及拉兹马宁碱与主要靶点(JUN、CASP3、CASP8、EP300)的结合活性较强。

本研究发现关键靶点的GO功能分析主要集中在凋亡信号、对脂多糖的反应、神经元凋亡过程的正调控、细胞凋亡执行阶段的细胞成分分解等生物学过程。KEGG富集分析结果显示青风藤治疗IMN的通路主要有MAPK信号通路以及cAMP信号通路。MAPK信号通路包括三个亚组:ERK、p38、JNK。ERK激活可促进表皮生长因子受体(EGFR)的上调表达,促进对细胞免疫至关重要的自分泌生长环,对ERK-MAPK信号的抑制剂研发是目前治疗自身免疫性疾病的新方向[17]。p38是MAKP信号通路的主要分支之一,p38通路通过产生大量不同的生物效应对细胞外部信号做出适当反应[18]。JNK直接参与细胞凋亡的线粒体途径,通过氧化应激激活JNK致使半胱天冬酶活化和凋亡,从而诱导细胞凋亡[19]。cAMP通路是G蛋白偶联受体 (GPCR) 触发的信号级联反应,它们会介导心脏和骨骼肌的上皮细胞功能和生理机能[20]。IMN 是一种免疫复合物相关的肾小球疾病,其与自身免疫系统问题密切相关;cAMP 通路可作为自身免疫性疾病和炎症性疾病的治疗靶点[21],故青风藤或许可成为单味中药免疫抑制剂的一种选择。

综上,青风藤中的β-谷甾醇、左旋千金藤啶碱和青藤碱等主要活性成分可能通过抑制MAPK、cAMP等信号通路作用于JUN、CASP3、CASP8等疾病靶点发挥抗炎症因子、调控细胞凋亡等生物功能,抑制足细胞损伤,从而起到保护肾脏,治疗IMN的效用。研究结果表明青风藤具有多通路,多靶点调控的特点,为临床运用青风藤治疗IMN提供了科学依据,也为进一步发掘青风藤潜在作用机制提供了新的方向。