谷维素对饲用米糠油酸价测定的影响

2024-01-11林仙军周芷锦陈晓林蔡文金

饲料工业 2023年24期

■ 王彬林仙军侯轩周炜周芷锦陈晓林蔡文金陈洁*

（1.浙江省动物疫病预防控制中心，浙江杭州 311199；2.绿城农科检测技术有限公司，浙江杭州 310052）

米糠油是从米糠中提取的油脂，富含油酸等营养物质，可为动物生长提供优质的营养物质，广泛应用于饲料的生产。米糠油的生产方式有压榨法和浸出法，其中，压榨法生产的米糠油又被称为米糠毛油，压榨碱炼后剩余的边角料俗称皂脚或油脚。米糠油中油酸与亚油酸比例接近WHO 推荐的1∶1 比例[1]，为公认的食用营养健康油，其不饱和脂肪酸高，也是一种被广泛使用的高热能饲料原料[2]，因其油料内含脂肪酶活性较高，本身酸价偏高，易发生油脂腐败[3-4]。酸价的定义为中和1 g 动植物油脂中游离脂肪酸所消耗的KOH 的毫克数[5]，其为衡量油脂品质的重要卫生指标，如GB/T 19112—2003 中明确规定了米糠油的分级标准及其酸价指标要求。米糠油本身为成分复杂的深色油脂，因国内还没有饲用米糠油的标准，饲用米糠油的精炼品质参差不齐，油脂中渗入皂脚或油脚的现象时有发生，在外观、纯度、均匀度等方面与食用米糠油差距较大，酸价测定的难度较高。

谷维素是一种由阿魏酸与植物甾醇结合形成的脂溶性有益成分，用于人体有降血脂、降胆固醇的功效[6]，其主要存在于米糠油、胚芽油等谷物油脂中，其中，米糠毛油含有1.7%～3.0%的谷维素[7]。研究表明，谷维素在酸价测定过程中会出现绿黄色和亮黄色，从而干扰滴定终点时溶液颜色的变化，造成表观酸价高于真实酸价的现象[8]。为探究谷维素对饲用米糠油酸价测定的影响，研究采用高效液相色谱法测定了饲用米糠油中谷维素的含量，分别用碱性蓝6B 指示法、百里香酚酞指示法、电位滴定法测定其酸价，通过谷维素添加试验探析谷维素对饲用米糠油酸价测定的影响，为饲用米糠油酸价测定提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

从饲料生产企业采集饲用米糠油2 批、饲用米糠2 批、食用米糠油1 批、饲用大豆油1 批，样品信息见表1。

表1 油脂和饲用米糠样品信息

γ-谷维素标准品：纯度≥99%（上海麦克林生化科技有限公司，批号：C14217665）；石油醚（30～60 ℃）：分析纯（上海凌峰化学试剂有限公司，批号：20181022）；氢氧化钾乙醇标准滴定溶液（0.101 1 mol/L）：本实验室自配和标定；无水乙醇：色谱级（永华化学股份有限公司，批号：20220415）；乙醇：分析纯（上海凌峰化学试剂有限公司，批号：20181112）；乙醚-异丙醇混合溶液（体积比1∶1），自配；酚酞指示剂（1%酚酞乙醇溶液）；百里香酚酞指示剂（2%百里香酚酞乙醇溶液）；碱性蓝6B 指示剂（称取碱性蓝1.0 g，加入50 mL煮沸的95%乙醇，在水浴中回流1 h，冷却后过滤）。

1.1.2 仪器与设备

MF10研磨机，德国IKA 公司；ME203E电子天平，瑞士Mettler 公司；XP205DU 精密电子天平，瑞士Mettler公司；DKZ-2电热恒温振荡水槽，上海精宏实验设备有限公司；3K15 冷冻离心机，德国Sigma 公司；R-210 旋转蒸发仪，瑞士BUCHI 公司；Agilent 1260 高效液相色谱仪配VWD 检测器，美国Agilent 公司；916 Ti-Touch 电位滴定仪配6.0229.100 非水相复合酸碱pH电极，瑞士万通有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 有机溶剂浸出法从饲用米糠中提取米糠油

取1 L 带密塞的试剂瓶5 个，向每个瓶中加入饲用米糠200 g 和石油醚（30～60 ℃）600 mL，用玻璃棒搅拌混匀后密塞，于往返式振荡器上振摇2 h。取出溶液及样品，置50 mL离心管中，于10 000 r/min 离心5 min，搜集并合并上清液，取上清液置水浴温度不高于40 ℃的旋转蒸发仪内，负压条件下，将其中的溶剂旋转蒸干，取残留的液体油脂作为饲用米糠油。

1.2.2 油脂中谷维素含量的测定

油脂中谷维素含量的测定方法采用LS/T 6121.2—2017。

1.2.3 滴定方法对饲用米糠油酸价测定的影响

样品酸价测定方法主要参考GB 5009.229—2016中第一法和第二法，其中，碱性蓝6B 指示剂的配制方法按1.1.1 中方法配制，与GB 5009.229—2016 稍有不同。以食用米糠油和饲用大豆油作为对照。称取样品2 g（饲用大豆油酸价较低，称样量为4 g）于锥形瓶（指示剂滴定法）或滴定杯（电位滴定法）中，加入乙醚-异丙醇混合溶液80 mL，充分振摇使试样溶解。分别用百里香酚酞指示滴定法、碱性蓝6B 指示滴定法和电位滴定法进行酸碱中和滴定试验。指示剂滴定法需加入指示剂4 滴，用氢氧化钾乙醇标准滴定溶液滴定至终点，滴定终点时，当颜色变为蓝色时为百里香酚酞的终点，碱性蓝6B 指示剂的滴定终点为由蓝色变红色，同时进行空白试验。

1.2.4 谷维素标准品溶液的配制

精密称取γ-谷维素标准品4 g，置于1 000 mL容量瓶中，用异丙醇超声溶解并定容至刻度（约4 mg/mL）。

1.2.5 空白溶剂中添加谷维素试验

取80 mL 乙醚-异丙醇混合溶液（酸价测定方法中的溶剂）于锥形瓶中，分别加入1.00、2.00、3.00、5.00、10.00、10.00、20.00 mL 谷维素标准品溶液，分别用百里香酚酞指示法和电位滴定法滴定，百里香酚酞指示法的滴定终点为溶液颜色变为蓝色，电位滴定法以最后一次突跃对应的点作为滴定终点。

1.2.6 谷维素对饲用米糠油酸价测定的影响

称取样品1 g于锥形瓶（指示剂滴定法）或滴定杯（电位滴定法）中，按表2 分别加入谷维素标准品溶液，依照1.2.3 中百里香酚酞指示法和电位滴定法测定油脂样品酸价。

表2 谷维素对饲用米糠油酸价测定的影响试验分组编号

1.3 数据统计与分析

试验数据用Excel 2010 软件进行初步整理和计算相对偏差或RSD（相对标准偏差），绘制空白溶剂谷维素添加量与滴定体积关系曲线图，拟合趋势方程分析线性关系（R2≥0.99 表示两者呈现显著线性关系）。采用SPSS 21.0 软件中“独立样本T检验法”分析饲料米糠油中添加谷维素试验中两种滴定方法酸价结果的差异，显著水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 油脂样品外观

由图1 可知，压榨法和浸出法生产的饲用米糠油外观均为深棕色，外观无明显差异。饲用米糠油的色泽与透亮度较食用米糠油及饲用大豆油有明显差异。

2.2 油脂中谷维素含量测定

6 组油脂样品中谷维素含量测定结果见表3 所示。结果表明，4 种饲用米糠油谷维素含量为1.6%～2.2%，均处于较高水平；饲用大豆油中未检出谷维素。

表3 油脂中谷维素含量（%）

2.3 滴定方法对饲用米糠油酸价测定的影响

滴定方法对饲用米糠油酸价测定的影响见表4和图2。图3～图6为电位滴定法测定样品酸价的电位滴定曲线。由表4和图2可知，碱性蓝6B指示法滴定饲料米糠油过程中溶液颜色渐变，即使严重过量滴定情况下，始终没有出现颜色突变的点，因此，碱性蓝6B指示剂不适用于饲用米糠油酸价的测定；4种米糠油样品中，百里香酚酞指示法测定的酸价均远大于电位滴定法；食用米糠油3种方法测定的结果相差较大（RSD=16.0%）；饲用大豆油3种方法测定的结果相近（RSD=1.5%）。

图2 3种油脂碱性蓝6B指示法测定酸价滴定终点颜色对比

图3 饲用米糠油A电位滴定曲线

表4 不同指示剂和电位滴定方法酸价测定结果（n=5）

由图2 可知，采用碱性蓝6B 指示法滴定时，食用米糠油滴定终点颜色为浅红色，比饲用大豆油滴定终点颜色要浅，而饲用米糠油滴定过程是颜色慢慢褪去（样品溶液起始为灰黄色，加入碱性蓝6B 指示剂后变为蓝色），渐渐恢复为本底灰黄色，再渐渐变为棕黄色，始终没有突变点。以上结果表明，深色油脂（米糠油）本底颜色对碱性蓝6B 的变色指示效果具有干扰效应，且本底颜色越深干扰越严重。

图3～图6 为电位滴定法测定样品酸价的电位滴定曲线，图中蓝色线为pH-滴定体积V 曲线，紫红色线为pH 随滴定体积变化的一阶导数曲线，即ΔE/ΔV-滴定体积V 曲线。由图3～图6 可知，饲用大豆油滴定过程只有一次pH 突跃，为典型的“S”型曲线（与GB 5009.229—2016中附录E中图E.1为同一类型），饲用米糠油和食用米糠油的滴定过程则有两次pH突跃，为多次不同pH范围“pH”突跃的“S”型曲线（与GB 5009.229—2016中附录E中图E.2为同一类型），应以“突跃”起始的pH最接近于7.5～9.5范围的突跃点作为滴定终点（如图3中EP1、图4和图6中EP2即判定为滴定终点）。

图4 饲用米糠油C电位滴定曲线

图5 饲用大豆油电位滴定曲线

图6 食用米糠油电位滴定曲线

2.4 空白溶剂中添加谷维素试验

两种方法测得的空白溶剂中谷维素的量与中和滴定终点体积的对比曲线图见图7，滴定体积数据见表5。由图7 可知，两种方法中和滴定试验消耗的滴定液体积均与谷维素的添加量呈极显著的线性关系（两组曲线R2分别为0.997 7 和0.999 2），百里香酚酞指示法与电位滴定法测定的滴定终点体积结果极为接近。由表5 可知，电位滴定法比百里香酚酞指示法测定结果的相对偏差要小，表明电位滴定法的精密度优于百里香酚酞指示法。

图7 两种滴定方法空白溶剂添加谷维素试验滴定终点体积对比

表5 两种滴定方法空白溶剂添加谷维素试验滴定终点体积（n=5）

图8～图10为电位滴定法测定空白溶剂中添加谷维素试验的电位滴定曲线。由图8～图10 可知，添加谷维素后，溶剂的滴定曲线由一次pH 突跃的“S”型变为两次pH 突跃的“S”型。第一次pH 突跃的点（对应紫红色线上第一个尖峰）对应的pH 在10 左右，符合GB 5009.229—2016 中测定酸价的滴定终点判定标准（pH 最接近7.5～9.5 范围的突跃点），此滴定点即为空白滴定体积，此滴定点位置随着谷维素添加量的增大未发生显著变化。第二次pH 突跃的点(对应紫红色线上第二个尖峰)对应的pH 在13左右，该突跃点位置随谷维素的添加量增大而不断后移，表明该突跃点是因谷维素而产生。

图8 电位滴定曲线（空白）

图9 电位滴定曲线（添加谷维素12 mg）

图10 电位滴定曲线（添加谷维素20 mg）

以上结果表明，在中和滴定过程中，谷维素会消耗氢氧化钾乙醇滴定液，致使滴定过程中产生一次pH 突跃，消耗滴定液的量与谷维素含量呈显著正相关关系。

2.5 谷维素对饲用米糠油酸价测定的影响

2.5.1 谷维素对饲用米糠油百里香酚酞指示法测定酸价结果的影响

由表6可知，随着谷维素含量的增加，A组和C组两种饲用米糠油酸价结果均显著升高，通过线性回归分析发现酸价和谷维素的添加量均呈显著的线性关系（两组曲线R2分别为0.998 5和0.993 9）。若以含相同量谷维素的溶剂作为空白，则计算得出的酸价趋势较为稳定（RSD分别为2.3%和3.6%），表明扣除掉谷维素消耗的滴定液体积后计算得出的酸价，应为其真实酸价。

表6 谷维素对饲用米糠油百里香酚酞指示法测定酸价结果的影响（n=4）

2.5.2 谷维素对饲用米糠油电位滴定法测定酸价结果的影响

谷维素对饲用米糠油电位滴定法测定酸价影响试验的滴定曲线见图12～图15。由图12～图15 可知，随着饲用米糠油样品中谷维素含量的不断增加，一阶导数曲线（图中紫红色曲线）的第二个尖峰的位置不断的向后移动，而第一个尖峰的位置未发生显著变化。第一个尖峰起始时对应的溶液的pH大约为9，符合GB 5009.229—2016 中酸价终点判定的标准（突跃点起始pH 最接近7.5～9.5 范围），第二个尖峰的位置对应的pH 均在12 左右，显然不符合酸价终点判定的标准，因此，应以第一个尖峰对应的体积为滴定终点。以上表明，谷维素不影响第一次pH 突跃的滴定体积，即不干扰游离脂肪酸与碱反应造成的pH 突跃的曲线，但会致使滴定终点后在滴定曲线上产生另外一次pH 突跃，此突跃可初判为谷维素与碱发生反应所引起。由于滴定结束后仪器会显示多个滴定体积，需要试验人员参考GB 5009.229—2016结合滴定曲线类型和滴定点所处位置及pH 进行综合判断，最终选出滴定终点。

图12 A1组试验电位滴定曲线

图13 A3组试验电位滴定曲线

图14 A5组试验电位滴定曲线

图15 A6组试验电位滴定曲线

由表7 可知，B 组和D 组两种饲用米糠油酸价均较为稳定，其6 组试验的组间RSD值分别为0.8%和1.4%，表明酸价与谷维素的含量没有显著关系。

表7 谷维素对饲用米糠油电位滴定法测定酸价结果的影响（n=4）

2.5.3 饲料米糠油中添加谷维素试验两种滴定方法酸价结果比较

将表6中饲用米糠油真实酸价和表7中酸价数据进行对比，结果分别见表8 和表9。由表8 和表9 可知，两种方法测定的酸价结果均无显著差异（P＞0.05），电位滴定法的精密度高于百里香酚酞指示法（RSD值更小）。

表8 饲料米糠油A中添加谷维素试验两种方法酸价结果比较

3 讨论

3.1 滴定方法对饲用米糠油酸价测定的影响

目前，油脂酸价测定的方法多采用GB 5009.229—2016 或ISO 660—2020，两个标准中适用于米糠油的测定方法均列出了冷溶剂指示剂滴定法和冷溶剂电位滴定法两种，其中GB 5009.229—2016 指明米糠油酸价指示剂滴定应采用碱性蓝6B 作为指示剂。有试验表明，指示剂滴定法测定酸价过程中，样品称样量、溶剂量、指示剂等均对酸价测定结果有一定影响[9]。为避免样品溶剂使用量、滴定液等对指示剂显色产生干扰，本试验中溶剂使用量均为80 mL，考虑到滴定液中水分可能致使皂化反应后生成的脂肪酸盐形成乳浊液或出现油水分层的现象，试验采用氢氧化钾乙醇标准滴定溶液。此外，为提高碱性蓝6B 指示剂的灵敏度，试验中使用的碱性蓝6B 指示剂未采用GB 5009.229—2016 中的乙醇直接溶解配制方法，而是参照GB/T264—1983采用热乙醇溶解并经热回流处理。

由图1 所示，饲用米糠油较食用米糠油色泽更深透亮度更差，因此，选择食用米糠油（颜色浅于样品的深色油脂，含有谷维素）和饲用大豆油（浅色油脂，不含谷维素）作为对照。如图2 所示，在滴定过程中溶液本底颜色对碱性蓝6B 指示剂指示剂的灵敏度具有不同程度的干扰，饲用米糠油本底颜色太深，该方法完全无法适用。由表4 可知，样品组中百里香酚酞方法测定的酸价结果显著大于电位滴定法测定的结果。从图3、图4、图6 可知，3 种米糠油酸价测定滴定终点所对应的pH 均在9.5 左右，前人试验确认，百里香酚酞指示剂在有机溶剂中变色范围为9.3～10.5[10]，碱性蓝6B 指示剂在95%乙醇中变色范围为9.5～11.2[11],因此，3 种方法滴定终点时溶液的pH 接近，所测定的酸价结果理论上应无显著差异，表4 中饲用大豆油的结果也从侧面证实了该理论的科学性。李英军等[12]试验采用指示剂滴定法和电位滴定法测定花生油、大豆油、植物调和油等7 种植物油脂的酸价，结果没有显著差异，但电位滴定法准确度和精密度更高；刘婷婷等[13]采用人工滴定法和自动电位滴定法测定番茄红素保健品的酸价，试验认为两种方法也没有显著差异；薛斌等[14]试验研究也认为除了米糠油外，电位滴定法对各类食用植物油酸值的测定结果与传统的人工指示剂滴定法的测定结果十分接近。可见，百里香酚酞指示法和电位滴定法中一定有一种方法测得的酸价结果失真。食用米糠油中百里香酚酞方法测定的酸价显著大于碱性蓝6B 和电位滴定法测得的酸价，而后两者的结果较为一致，则可从侧面证实是百里香酚酞指示剂测定的酸价结果失真，即表观酸价大于真实酸价。程岁寒等[15]研究认为深色油脂酸价测定时，指示剂滴定法检测结果存在偏差，电位滴定法测定的结果不受油脂本身颜色的干扰，以上试验也印证了前人的研究结果。

3.2 谷维素对饲用酸价测定的影响

谷维素本身为白色结晶，在有机溶剂中溶解后为无色溶液，溶液本底不会对指示剂的显色产生干扰。有研究认为谷维素导致油脂酸价测定值升高的原因可能有两点：①谷维素与碱溶液反应生产浅黄色或亮黄色物质；②谷维素分子结构中酚羟基一定条件下可与碱基发生反应，从而消耗碱性滴定液的用量[16]。因此，能确认是在滴定过程中谷维素与碱反应产生了有色物质干扰了滴定过程中溶液颜色的变化，这种物质的干扰致使碱性蓝6B 完全失去了指示作用，并使百里香酚酞指示剂测定值偏大。空白溶剂中添加谷维素试验表明，溶剂在碱滴定中消耗的体积与谷维素含量呈显著正相关，且百里香酚酞指示法与电位滴定法测定的滴定体积结果并无显著差异。依照图7 中谷维素含量与滴定液消耗体积标准曲线，按照天然米糠油中谷维素含量1.7%～3.0%计算，百里香酚酞指示法所测表观酸价将比真实酸价偏高3.5～6.1 mg/g。

对于电位滴定方法，谷维素的存在可使油脂样品滴定过程中除游离脂肪酸与碱反应产生的第一次电位突跃后再出现一次电位突跃，由于谷维素产生的电位突跃点对应的pH 已在12 左右，并不干扰游离脂肪酸导致的电位突跃，对酸价的测定无显著影响。因百里香酚酞指示剂在有机溶剂中变色范围为9.3～10.5，也表明由于谷维素的存在致使米糠油酸价测定中百里香酚酞的变色范围从下限9.5 左右变成了12 左右。

由表8 和表9 可知，电位滴定法的精密度高于指示剂滴定法，表6 和表7 中电位滴定法测定的酸价的相对偏差也显著低于百里香酚酞指示法，许多研究结果均表明，电位滴定法的精密度和准确度均高于指示剂滴定法[12，14-15]，尤其在深色油脂的酸价测定时，指示法受到本底颜色的干扰作用更强，结果偏差更大，因此，饲用米糠油的酸价测定应首选电位滴定法，以确保结果的准确可靠。对于没有条件使用电位滴定法的实验室，可使用百里香酚酞作为指示剂测定酸价，但需要测定样品中的谷维素含量，在酸价测定时向溶剂中添加相同量的谷维素作为空白对照。金俊等[17]研究也认为可以通过大豆油添加相同浓度谷维素计算表观酸价与真实酸价的差值，然后测定米糠油的表观酸值,再减去差值得到真实酸值。