富精氨酸小肽对肉鸡肝脏功能的保护作用

2024-01-11战晓燕滑志民陈菊红刘志国

饲料工业 2023年24期

■ 战晓燕滑志民陈菊红刘志国

（1.南京农业大学动物医学院，江苏南京 210095；2.上海农林职业技术学院，上海 201699；3.辽宁威兰生物技术有限责任公司，辽宁沈阳 110020）

肉鸡生长速度快，其免疫系统和肝脏功能发育相对不完善，易遭受各种病原菌的侵袭。脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分之一，也是其侵袭宿主的关键成分，可引起机体产生严重的炎症反应，破坏肝脏结构和功能，对动物的全身性健康和生产性能都可造成很大危害[1]。

研究发现LPS 对巨噬细胞和肾脏的刺激会增加精氨酸的消耗并抑制精氨酸的产生[2]，说明精氨酸的耗竭可能在LPS 诱导机体损伤反应的过程中起到重要作用。精氨酸是一种重要的功能性氨基酸，也是家禽的一种必需氨基酸，在机体免疫反应过程中发挥重要功能。体外研究表明精氨酸可调节肝细胞免疫反应[3]，缓解细胞炎症反应和死亡[4]。添加精氨酸可调节肉鸡内脏器官中白介素和干扰素等细胞因子的表达[5]，减轻LPS 刺激引起的畜禽炎症反应和肝脏损伤[6-7]。以上研究结果表明精氨酸具有缓解LPS 诱导肉鸡肝脏损伤的潜力。目前在畜禽生产中使用的精氨酸产品通常是L-精氨酸单体，研究表明动物消化道对小肽吸收效率高于氨基酸[8-9]，小肽形式可能比游离氨基酸形式的精氨酸的功效更好[10-11]。故本试验拟探究一种新的精氨酸源-富精氨酸小肽（arginineriching small peptide, ARSP）对LPS 刺激下肉鸡肝脏功能的保护作用，从而评估其在养殖中的应用价值，以期为ARSP作为一种新型精氨酸源在养殖中的应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

ARSP（辽宁威兰生物技术有限责任公司提供）是以豆粕和玉米浆干粉为发酵原料，以精氨酸产生菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌和植物乳杆菌作为发酵菌群，在特定生产工艺条件下发酵生成。ARSP 中粗蛋白含量为52%，小肽（分子量低于2 000 u）含量在12%以上，精氨酸含量为3.26%。LPS（货号L2880）来源于大肠杆菌O55:B5，购自Sigma公司。

1.2 试验设计

选择120 只1 日龄AA 肉公鸡[初始体重（49.85±1.92） g]按照2×2 因子设计随机分为4 个组：对照组、LPS 组、ARSP 组和ARSPL 组，每组3 个重复，每个重复10 只鸡，各重复之间的初始体重无显著差异。其中，对照组和LPS 组肉鸡饲喂基础日粮，ARSP 组和ARSPL组肉鸡饲喂基础日粮并添加0.5%ARSP。基础日粮组成及营养水平见表1。LPS组和ARSPL组肉鸡于第27、29、31 天分别腹腔注射LPS（1 mg/kg 体重）一次，对照组和ARSP组于相同时间注射等量生理盐水。于31 d 注射后3 h 和12 h 后，从每个重复中随机挑选一只鸡进行翅静脉采血并分离肝脏，剪取一小块肝脏样，液氮速冻后保存于-80 ℃。

表1 基础日粮组成及营养水平

1.3 饲养管理

试验鸡采用立体笼养、人工持续光照制度，育雏时采用红外灯供暖，保持正常温度（第1 周33～34 ℃，第2 周27～31 ℃），其后视具体气温情况供暖；鸡舍自然通风，相对湿度保持在55%～65%。试验期间鸡自由采食和饮水，每天观察鸡群的健康状况，及时处理死鸡并记录。按饲养常规进行鸡舍消毒并对鸡只进行免疫。

1.4 指标分析

1.4.1 血清肝功能酶的活性

将采血管中的血液倾斜放置2 h 后，在4 ℃以3 000 r/min 离心20 min，取血清装于离心管中，放入-20 ℃冰箱中保存。采用比色法测定血清中谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）以及碱性磷酸酶（ALP）的活性。试剂盒购自南京建成生物工程有限公司。

1.4.2 肝脏细胞因子的含量

称取0.2 g肝脏组织样品，加入9倍体积预冷的磷酸盐缓冲液进行匀浆，将匀浆液以8 000 r/min 离心10 min，分离上清液，稀释至适当倍数，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测肝脏匀浆上清液中细胞因子,包括白介素（IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10 和IL-12）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量。以上所有试剂盒均购自南京建成生物工程有限公司。

1.4.3 肝脏基因的mRNA相对表达量

采用试剂盒FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit（南京诺唯赞生物有限公司）提取肝脏样品总RNA，使用Nano-drop2000 检测上述RNA 的浓度和纯度，再用1%琼脂糖凝胶电泳法检验RNA 样品的完整性。采用HiScript Ⅱ qRT Super Mix for qPCR 试剂盒（南京诺唯赞生物有限公司）对上述RNA 样品进行反转录得到cDNA 样品，随即采用2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 试剂盒（南京诺唯赞生物有限公司）在Apllied Biosystems ABI-7500 仪器上进行qPCR 反应。反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性15 s；再分别于58.1、60.1、62.0 ℃和64.0 ℃退火15 s；72 ℃延伸30 s，历经30个循环；最后于72 ℃彻底延伸5 min。各基因引物序列信息如表2 所示。采用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。

表2 引物序列信息

1.5 统计分析

试验结果以“平均值±标准差”来表示，利用SPSS 20.0 软件中GLM 过程中的two-way ANOVA 对结果进行分析。方差分析显著时，用Duncan’s 法做多重比较，以P＜0.05 作为差异显著的判断标准，0.05＜P＜0.10则认为趋向显著。交互作用显著时，采用one-way ANOVA进行分析。

2 结果与分析

2.1 血清肝功能相关酶活性的测定结果

由表3 可知，血清AST 和ALT 活性在LPS 注射后3 h 显著增加（P＜0.05），血清AST 和ALP 活性在LPS注射后12 h显著增加（P＜0.05）。ARSP 处理可显著降低）注射后3 h血清ALP活性（P＜0.05），并有降低注射后3 h血清AST活性的趋势（P=0.063）。

表3 注射LPS后肉鸡血清肝功能相关酶的活性 (U/L)

2.2 肝脏细胞因子含量的测定结果

如表4所示，肝脏中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12及TNF-α的含量在LPS注射后3 h和12 h均显著增加（P＜0.05）。LPS注射后3 h，ARSP处理显著减少肝脏中IL-4 和IL-8 的含量（P＜0.05）。LPS 注射后12 h，ARSP处理显著减少肝脏中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12及TNF-α的含量（P＜0.05）。此外，在LPS注射后3 h和12 h，ARSP与LPS之间对肝脏细胞因子含量存在交互作用，ARSP显著降低了LPS注射组肉鸡肝脏中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α的含量（P＜0.05）。

表4 注射LPS后肉鸡肝脏细胞因子的含量（ng/L）

2.3 肝脏细胞因子mRNA相对表达量的测定结果

由表5 可知，肝脏细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12α、IL-12β和INF-γ的表达量在注射LPS 后3 h和12 h都显著上调（P＜0.05）。在LPS 注射后3 h，ARSP 处理显著下调（P＜0.05）肝脏IL-12β和INF-γ的表达量（P＜0.05）；而在LPS注射后12 h，ARSP处理显著下调肝脏INF-γ的表达量（P＜0.05）并有下调IL-1β表达量的趋势（P=0.059）。ARSP与LPS之间对肝脏细胞因子表达量存在交互作用（P＜0.05）：在LPS注射后3 h，ARSP显著下调LPS 组肉鸡肝脏中IL-1β、IL-6、IL-12α、IL-12β和INF-γ的表达量（P＜0.05）；而在LPS 注射后12 h，ARSP显著下调LPS组肉鸡肝脏中IL-1β、IL-8和INF-γ的表达量（P＜0.05）。

表5 注射LPS后肉鸡肝脏细胞因子的mRNA相对表达量

2.4 肝脏炎症信号分子mRNA相对表达量的测定结果

由表6 可知，注射LPS 后3 h 和12 h，肝脏中炎症信号分子TLR2、TLR4、NF-κB p65和TRAF6的表达量均显著上调（P＜0.05）。ARSP 与LPS 之间对上述信号分子表达量存在交互作用（P＜0.05），表现为：ARSP 对正常组肉鸡肝脏TLR2、TLR4、TRAF6和NF-κB p65的表达量无显著影响（P＞0.05），但显著下调LPS 注射组肉鸡肝脏中TLR2和TLR4表达量以及NF-κB p65（注射后12 h）和TRAF6（注射后3 h）的表达量（P＜0.05）。此外，在注射后3 h 时，ARSP 还有下调LPS 注射组肉鸡肝脏NF-κB p65表达量的趋势（P=0.057）。

表6 注射LPS后肉鸡肝脏炎症信号分子的mRNA相对表达量

3 讨论

肝脏是体内最大的实质脏器，是营养物质代谢与合成的关键器官。肠腔中一些细菌代谢产物可通过门静脉易位到肝脏中，导致肝脏损伤，进而危害机体的全身健康。LPS 是革兰氏阴性病原菌细胞壁中的关键抗原成分，可诱导肉鸡肝脏炎症反应[12]。研究表明缓解LPS 造成的肝脏炎性损伤对于家禽健康具有重要意义[13]。

保护畜禽肝脏健康的方法主要有药物性手段和营养性手段，而后者安全性高且能起到一定的预防效果，因而在养殖业中备受推崇。补充精氨酸是缓解畜禽肝脏损伤的一个重要营养性手段[7]。目前动物生产中使用的L-精氨酸单体，而动物对小肽的利用比对氨基酸的利用更高效[10-11]，小肽形式可能比游离形式的精氨酸更好地发挥作用功效。故本试验探究了ARSP（作为一种新的精氨酸源）对LPS 刺激下肉鸡肝脏功能的保护效果。

LPS 刺激可引起肝细胞膜通透性增加甚至坏死，使得肝细胞内的酶释放进入血液中，故血清中与肝功能相关的酶（如ALT、AST 和ALP）的活性可反映肝脏损伤程度。很多研究表明，LPS刺激可增加血清ALT、AST 和ALP 的活性[12，14]。本试验同样发现LPS注射后3 h 和12 h，肉鸡血清ALT、AST 和ALP 的活性显著增加，证实LPS 引起了肉鸡肝细胞损伤。而添加ARSP可降低肉鸡血清ALT、AST 和ALP 的活性，说明ARSP对 LPS 引起的肉鸡肝脏损伤具有缓解作用。前人研究表明饲粮中补充精氨酸可缓解禽腺病毒导致的肉鸡肝细胞损伤[15]及LPS 刺激导致的仔猪肝脏结构破坏和功能紊乱[7]。

在LPS 注射后数小时之内，会引起机体较强的炎症反应，肝脏产生和释放大量细胞因子，比如IL 和TNF[16]，并呈现时间依赖性变化[17]。与此同时，为了尽可能减轻炎性介质对自身组织造成的损伤，机体同时存在着复杂的抑炎机制，比如分泌一些抗炎因子[1]。在本试验中，我们观测到肝脏中促炎因子（IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8 和IL-12）和抗炎因子（IL-4 和IL-10）的含量在LPS 注射后的3 h 和12 h 基本都显著增加，表明LPS 刺激导致了肉鸡肝脏炎症反应的发生，后者同时也反馈性引起肝脏抗炎反应的发生，这是机体的一种自我保护机制。但这种保护机制可能加剧营养消耗，最终不利于肉鸡生长性能的发挥。精氨酸可调节免疫细胞的功能，在动物机体免疫反应以及抗炎症过程中发挥重要作用[18-19]。有研究表明饲粮精氨酸可缓解LPS 诱导的动物肝脏炎症反应和损伤[5，15]。本试验发现饲粮中添加ARSP 缓解了LPS 刺激引起肉鸡肝脏中多种促炎因子含量的增加，进而反馈性引起肝脏中抗炎因子分泌减少（含量下降）。除了炎症因子的含量，我们还同时测定了肉鸡肝脏炎症因子mRNA 表达量的变化。测定结果同样表明LPS显著上调肝脏促炎因子（IL-1β、IL-6、IL-12α、IL-12β和INF-γ）的表达量，而添加ARSP 逆转了LPS 刺激引起的上述促炎因子表达量的上调。以上结果证实ARSP可有效抑制LPS引起的肉鸡肝脏炎症反应。

TLRs 是细胞膜表面的一类跨膜信号转导体家族，其中的TLR2 和TLR4 可识别LPS，经过下游通路的介导引起胞内NF-κB 等信号通路的激活，最终启动各种炎性介质的产生[20-21]。当TLR4或TLR2与LPS结合后，在CD14 分子的协助下转移至TLR4-MD2 复合体，引发下游级联免疫反应，募集髓样分化因子88（MyD88）和TRIF 等接头分子。TLR4 既能通过MyD88/TIRAP（MyD88 依赖性途径）也可通过TRIF/TRAM（MyD88 非依赖性途径）将信号传导至胞内，进而作用于TRAF6。TRAF6 的活化可引起NF-κB 抑制因子（IκB）激酶（IKKs）活化，导致胞浆中IκB 磷酸化，其中的IκBα与NF-κB 二聚体（p50-p65）发生解离，游离出来的NF-κB p65 亚基随即转移到细胞核内与DNA 特定片段结合，从而启动一系列炎症基因的表达[22]。本试验中，肉鸡肝脏中炎症信号分子TLR2、TLR4、NF-κB p65和TRAF6的表达量在LPS注射后3 h和12 h 均显著上调，提示LPS 可通过TLR2/NF-κB 和TLR4/NF-κB通路诱导肉鸡肝脏炎症反应。前人研究表明精氨酸可通过代谢产生一氧化氮来调节TLR4信号通路的状态[23]。在肉鸡上的研究发现饲粮中补充精氨酸可通过抑制TLR4 信号通路缓解LPS 诱导肉鸡全身性和肠道炎症反应[24]，在仔猪上的研究表明饲粮精氨酸可抑制TLR4/NF-κB通路缓解LPS诱导肝脏炎性损伤[25]。本试验中，无论是注射后3 h 还是12 h，ARSP 处理都缓解了LPS 刺激引起的肝脏中TLR4和TLR2表达量上调，并缓解了注射后12 h 时肝脏NFκB p65表达量上调以及注射后3 h 时肝脏TRAF6表达量上调，这些结果表明了ARSP 可通过抑制TLR4/NF-κB或TLR2/NF-κB信号通路的激活减轻LPS诱导肉鸡肝脏炎症反应，进而有利于缓解肝脏损伤（血清肝功能相关酶活性的增加）。