电针不同穴位对腹泻型肠易激综合征大鼠不同肠道症状的比较性研究*

覃 颖 秦丽娜△ 任晓暄 朱文莲 王一凡

（1.北京中医药大学第三附属医院，北京 100000；2.北京中医药大学，北京 100029）

肠易激综合征（IBS）［1-2］是以腹痛、腹胀为主症，伴有反复大便异常如腹泻、水样便或便秘等的功能性肠道疾病，其中腹泻型肠易激综合征（IBS-D）是IBS最常见的亚型。合谷与天枢分别为手阳明大肠经、足阳明胃经的重要穴位，阳明经多气多血，且两者是同名经，根据经络同气相求理论，两者治疗胃肠道疾病均具有显著疗效。故此二穴均可用来治疗IBS-D，但两者的穴位及所属经络等有差异。本实验以IBS-D 大鼠为模型，观察电针合谷、天枢对Bristol 大便评分、腹部回撤反射（AWR）以及结肠肌层C-kit 和黏膜层5-HT3A 受体表达的影响，探究电针两穴位对IBS-D 肠道痛敏和动力异常是否具有疗效及有何差异。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级Wistar 孕鼠5 只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK-（军）2016-0006。清洁饲养，湿度为50%左右，室温稳定值为（23±2）℃，自由饮水。待幼鼠出生后，按照随机数字表法分为正常组、模型组、合谷组和天枢组，每组10只。除正常组外，其余均进行模型制备，饲养条件相同。本实验符合实验动物伦理委员会伦理学规定。

1.2 试药与仪器

ER-182A 型电子秤（日本AND）、BL-420 S 生物机能实验系统（成都泰盟科技有限责任公司）、LH-202H型电针仪（北京祯怡科技发展公司）、毫针（0.30 mm×13 mm，北京中研太和科技有限公司），Leica RM 2235组织切片机、BARD-FOLEY 双腔导尿管（美国BARD）、bx 51 显微镜、Anymicro DSSTM 图像采集系统（日本Olympus）、TB-718生物组织包埋机（湖北泰维科技实业有限公司）、Leica ST 5020徕卡全自动组织脱水机（德国徕卡）、Leica HI 1220 烤片机。5-HT3AR 抗体、c-kit试剂盒（美国Abcam），酶标山羊抗小鼠/兔IgG二抗、浓缩DAB 溶液（无锡傲锐东源生物科技有限公司），乙酸、液体石蜡（北京化学试剂公司），2%戊巴比妥钠（北京欧北科技生物科技有限公司），10%中性甲醛（北京百诺威生物科技有限公司）。

1.3 模型制备

除正常组外，其他3 组进行母婴分离、幼鼠醋酸灌肠和结直肠扩张（CRD）制备IBS-D 模型［3-6］。幼鼠出生2～21 d每天上午3 h母婴分离，并在幼鼠出生8～21 d进行醋酸灌肠刺激（具体方法：用石蜡油润滑直径1 mm的中心静脉导管，缓慢插入幼鼠肛门，灌注量见表1）。在6 周龄时给予CRD 刺激3 次，每次间隔5 min（石蜡油润滑6F 导尿管插入大鼠肛门6 cm 左右），匀速缓慢（0.5 mL/min）注水0.5 mL 扩张结直肠，维持30 s，以发生腹部抬起为准，保证模型的稳定性。普通饲料喂养至8周龄。

表1 IBS-D模型幼鼠醋酸灌注量

1.4 干预方法

在第9 周两穴位组在相应穴位进行电针干预。穴位选择［7］：合谷（大鼠前肢，第2 掌骨桡侧缘的中点处）、天枢（大鼠腹部，脐两侧旁开约5 mm）。具体操作：用黑布套固定大鼠，针刺相应穴区，并在穴位旁开1 mm 处再刺1 针；两针与电针仪的正负极连接，同一对正负极连接同穴区的两针柄，疏密波，频率为2 Hz/100 Hz，强度为0.1～0.3 mA，以大鼠肢体微颤动为度，共5次治疗，隔日1次，每次治疗20 min。模型组仅黑布套固定；正常组不予任何干预。

1.5 指标检测

1.5.1 Bristol便型评分 干预前后，每组随机选6只大鼠观察其大便性状。根据Bristol 粪便分类法［8］分为7型：1 型为硬颗粒状；2型为多个硬球粒粘成的团块状；3 型为有褶皱和裂纹的香肠状；4 型为较光滑的长条状；5型为光滑的块状；6型为粥糊样状；7型为液体状。分型数值越高表示大便性状越稀软。其中，1、2 型表示便秘；3、4型表示正常大便；5～7型表示腹泻。

1.5.2 腹部回撤反射（AWR）检测 参照并改良Al-Chaer［9］的AWR 检测肠道痛敏，禁食不禁水8 h 后进行操作。将直结肠扩张球囊（自制）、微量注射泵、压力换能器等与BL-420S 生物机能实验系统连接，确保连接通路的密封性。打开电脑及该实验系统软件。将大鼠放至与微量注射泵同水平处固定，将石蜡油涂抹于球囊头端并缓慢插入大鼠肛门，深度约8 cm。打开微量注射泵，匀速缓慢注水（1 mL/min），共1.5 mL，球囊扩张时间为90 s。记录起始收缩波的潜伏期、收缩波总个数。每只大鼠分别检测3 次（间隔半小时以上），取其平均值，保证实验结果的准确性。

1.5.3 免疫组化法检测结肠中5-HT3AR 和C-kit的表达 治疗结束后，每组随机处死6只大鼠，取1 cm 长的结肠组织（距肛门约8 cm 处），用4%甲醛固定结肠组织、梯度脱水、浸蜡、石蜡包埋、切片。PV-6000二步免疫组化法染色：根据试剂盒说明进行。组织切片为蓝紫色，阳性表达物为棕褐色。分析图像数据，采用Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统采集，在高倍镜下（400 倍）观察结肠肌层C-kit 和黏膜层5-HT3AR 免疫反应物的阳性表达，每张切片随机取2 个视野，每组共10 个视野，测定阳性面积和累积光密度值，计算平均光密度值。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠Bristol粪便评分比较

见表2。电针治疗前，模型组、合谷组和天枢组的Bristol 评分明显高于正常组（P＜0.01），说明造模成功。电针治疗后，两电针组的评分较模型组均明显降低（P＜0.01）；天枢组评分较合谷组明显降低（P＜0.01）。

表2 各组大鼠Bristol粪便评分比较（分，±s）

表2 各组大鼠Bristol粪便评分比较（分，±s）

注：与正常组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；与模型组比较，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；与合谷组比较，★★P ＜0.01。下同。

电针后3.83±0.41 5.17±0.75△△4.33±0.52▲▲3.50±0.55▲▲★★组 别正常组模型组合谷组天枢组n6666电针前3.67±0.52 5.50±0.55△△5.17±0.1△△5.17±0.75△△

2.2 各组大鼠腹部回撤反射比较

见表3。模型组较正常组的潜伏期缩短、收缩波个数增多（P＜0.01）；两穴位组较模型组的潜伏期明显增加、收缩波个数明显减少（P＜0.01 或P＜0.05）；与合谷组比较，天枢组潜伏期收缩波个数无明显变化（P＜0.05）。

表3 各组大鼠肠道收缩潜伏期、收缩波个数比较（±s）

表3 各组大鼠肠道收缩潜伏期、收缩波个数比较（±s）

组 别正常组模型组合谷组天枢组n 10 10 10 10潜伏期（s）83.66±6.78 54.77±7.64△△75.26±8.65△▲▲75.41±6.32△▲▲收缩波个数（个）0.93±0.68 2.58±0.52△△1.28±0.66▲▲1.30±0.67▲▲

2.3 各组大鼠结肠肌层C-kit阳性表达比较

见表4、图1。与正常组比较，其他3 组C-kit 阳性表达明显升高（P＜0.01 或P＜0.05）；两电针组较模型组C-kit 的阳性表达明显降低（P＜0.01）；天枢组C-kit的阳性表达较合谷组明显降低（P＜0.01）。

图1 各组大鼠结肠肌层C-kit阳性表达（免疫组化染色，400倍）

表4 各组大鼠结肠肌层C-kit、5-HT3AR阳性表达比较（×10-3，±s）

表4 各组大鼠结肠肌层C-kit、5-HT3AR阳性表达比较（×10-3，±s）

组 别正常组模型组合谷组天枢组n6666 C-kit 3.31±0.99 13.44±3.15△△7.11±1.63△△▲▲5.33±1.56△△▲▲★5-HT3AR 4.01±1.31 18.66±2.11△△6.28±1.10△▲▲7.32±1.52△△▲▲

2.4 各组大鼠结肠黏膜层5-HT3AR阳性表达比较

见图2、表4。与模型组比较，其他3 组5-HT3AR的阳性表达明显升高（P＜0.01 或P＜0.05）；两电针组较模型组的5-HT3AR 阳性表达明显降低（P＜0.01）；两电针组之间的5-HT3AR阳性表达相近（P＞0.05）。

图2 各组大鼠结肠黏膜层5-HT3AR阳性表达（免疫组化染色，400倍）

3 讨 论

IBS-D 的发病机制尚未完全明确，西医主要是对症治疗，短期内有效，但复发率高、依赖性强，有一定的副作用。针灸治疗IBS-D 具有安全性高、无副作用、疗效持续稳定等优势，多穴组合针刺、艾灸、针灸联合等中医外治法已被证实对改善IBS-D症状具有明显疗效［10-11］。但关于单穴治疗IBS-D及经穴效应特异性的研究并不多。本研究在针灸获得国际广泛认可的前提下，以IBS-D 模型大鼠为模型，通过针刺合谷与天枢穴，探究不同穴位对IBS-D的疗效及差异。

本实验采用Bristol 评分及免疫组化的方法，研究电针合谷与天枢穴对IBS-D 的疗效差异及相关机制。合谷与天枢穴分别属于手、足阳明经，阳明经多气多血，因此两者均有调肠活血、通络止痛、调节胃肠道运动的作用。古代文献将合谷列为治疗痛证的要穴，在临床上对腹痛、痛经、胃癌痛等痛证都有一定的疗效［12-14］。天枢穴可以抑制肠胃蠕动、改善因肠胃过度活动引起的腹泻，对内脏有很好的双向调节作用［15-16］。

合谷与天枢穴可使IBS-D 模型大鼠的Bristol 评分降低、AWR 的潜伏期延长、收缩波个数减少，同时降低结肠肌层C-kit、结肠黏膜层5-HT3AR 的表达。但两穴的治疗效应有其特异性，从便型评分以及结肠肌层C-kit的表达结果可看出，天枢穴对肠道动力异常的效果明显优于合谷穴。5-HT 是介导胃肠功能神经调节的重要神经递质［17］，约90%的5-HT 存在于胃肠道中，参与调节肠道蠕动反射和感觉继发［18］。5-HT 与5-HT3R 结合可刺激胃肠道分泌，进而影响肠道痛敏［19-20］。Cajal 间质细胞（ICC）是胃肠起搏细胞，是介导肠神经系统和调节胃肠动力的重要信号传递［21］，是治疗IBS的重要因子［22］。c-Kit受体是ICC基因表达的标志物［23］，可介导平滑肌收缩、内脏敏感痛等，为肠神经系统和ICC提供营养支持。

天枢穴对IBS-D 肠道痛敏和动力异常的疗效更优，其机制可能在于天枢穴的近治作用及神经节段支配理论。天枢穴的神经节段支配为T6～T12［24］，与结肠的神经节段有重合，刺激天枢可将冲动信号直接投射于大肠的神经节段分布区。因此天枢穴对肠道功能有很好的调节作用。不同经络和不同神经节段支配的穴位对肠道高敏感性与动力异常的疗效确实存在特异性，其具体机制有待进一步深入研究。