桃红四物汤介导TLR2 抑制破骨细胞分化促进骨折愈合的机制研究*

李 为 吴 涛 周 灿 申 楠吴健钮张天择 杨强健 陈佳佳 陆小龙 汤 智△

（1.湖南省湘潭市中医医院，湖南 湘潭 411199；2.湖南省湘潭市第一人民医院，湖南 湘潭 411104；3.湖南中医药大学，湖南 长沙 410007；4.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410021）

骨折是由于遭受外力导致骨的完整性和连续性中断的现象，特征主要有患处畸形、运动异常、骨擦感。随着经济的不断发展，各类突发状况的加多，各种意外情况所导致的骨折日益增多［1］。临床流行病学研究表明，5%～10%的骨折患者存在骨折愈合失败的风险，其中股骨最高达到13.9%的骨折愈合失败风险［2］。本课题组在长期临床工作和实践中发现，中医活血化瘀的代表性方剂桃红四物汤，能够加快胫腓骨骨折愈合，使骨折愈合的效率显著升高［3］。研究表明，TLR2 信号通路的激活可促进多种疾病的血管生成［4］，并且参与了调控破骨细胞分化的过程［5］。据此，本研究旨在探讨桃红四物汤介导TLR2 抑制破骨细胞分化促进骨折愈合的机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

RAW264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞），货号：CL-0190，购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

1.2 实验药物

桃红四物汤，组方：桃仁20 g，红花10 g，当归20 g，生地黄20 g，赤芍20 g，川芎10 g［6］。饮片由湖南中医药大学第二附属医院药剂科中药房提供。研磨药材并加水浸泡30 min，然后通过用沸水冲洗2 h 提取，在65 ℃下液泡成颗粒。3.78 g 桃红四物汤药材可以制成1 g颗粒。将桃红四物汤颗粒密封，室温无光条件下保存。用时将颗粒溶于完全培养基中，制成600 μg/mL的桃红四物汤水提液。

1.3 试剂与仪器

DMEM 培养基购自Giboco 公司，RANKL、TLR2 激动剂均购自Sigma 公司，TLR2 抗体购自Abcam 公司，30%甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、Tris、Real Band 蛋白预染Marker、20×TBS 缓冲液、脱脂奶粉均购自上海生工公司，SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（1×）、TEMED、SDS、BeyoCoLorTM彩色预染蛋白分子量标准、RIPA 裂解液（强）、TEMED、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（增强型）均购自上海碧云天公司，PVDF 膜购自上海默克化工技术有限公司，NaCl 购自美国科赛特科技有限公司，超敏ECL 化学发光试剂盒（250 mL）购自苏州新赛美生物科技有限公司，甲醇购自国药集团化学试剂有限公司，TRIzol 购自Thermo Fisher Scientific，RNase-free Water 购自索莱宝，异丙醇、无水乙醇均购自天津恒兴，逆转录试剂盒购自genecopoeia，Beyo-FastTMSYBR Green qPCR Mix 购自Bio-Rad，200 μL PCR 管（无酶）、10 μL 枪头（无酶）均购自NEST，α-MEM 培养基购自深圳华晨阳科技有限公司，稳压电源（电泳用）、SDS-PAGE 蛋白电泳仪、蛋白转膜仪、化学发光成像系统、垂直电泳槽、转印电泳槽、电泳仪、化学发光成像系统均购自上海天能，脱色摇床购自其林贝尔，台式高速冷冻离心机、台式高速冷冻离心机均购自HeaLForce，雪花制冰机购自雪科，超纯水仪购自ELGA，荧光定量PCR 仪购自德国耶拿，多功能酶标仪购自PerkinELmer。

1.4 细胞模型与分组

将RAW 264.7 细胞在含有10%胎牛血清、4 mmoL谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素的DMEM 培养基中培养，在5%CO2、37 ℃的环境下培养1～2 d，使细胞传代，对数生长。再将细胞分为对照组、桃红四物汤组、TLR2组、桃红四物汤+TLR2 组。对照组：RAW 264.7 细胞需要在含100 μg/L RANKL 的α-MEM 培养基中进行诱导，培养基中的液体需要隔天换1 次，通过4～5 d 的诱导培养后能产生足量的多核细胞。桃红四物汤组：RAW 264.7 细胞在上述相同培养基中进行诱导，诱导的第3天加入600 μg/mL的桃红四物汤水提物，再孵育48 h。TLR2组：RAW 264.7细胞先在TLR2激动剂中预处理1 h，再使用上述相同培养基进行诱导。桃红四物汤+TLR2 组：RAW 264.7 细胞先在TLR2 激动剂中预处理1 h，然后在上述相同培养基中进行诱导，诱导的第3天加入600 μg/mL的桃红四物汤水提物，再孵育48 h。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色 选用2.5%戊二醛固定细胞，用二甲基甲醛将底物进行充分溶解，再将缓冲液倒入其中；将亚硝酸钠和副品红按照1∶1的比例进行混合，放置于安静状态下1 min，再将缓冲液加入；最后将酒石酸加到缓冲液中，TRAP 染液完成配置。在37 ℃的培养皿中加入TRAP染液，进行1 h染色；用蒸馏水将细胞清洗干净，再用1%甲基绿对其细胞核进行再次染色；破骨细胞染色后，呈现出宝石红色，且核红染的细胞不少于3 个，即为TRAP+破骨细胞；最后进行拍照，观察每张玻片的TRAP 染色为阳性的破骨细胞，并将数量进行记录。

1.5.2 实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR） 通过Total RNA 提取，反转录，实时荧光定量PCR，PCR 结束后用2-ΔΔCt分析方法对所记录的数据进行分析。

1.5.3 蛋白质印迹实验（WB） 通过总蛋白抽提与定量，电泳，转膜，封闭后将在4 ℃下一抗孵育；然后洗膜，室温下孵育PVDF膜2 h，进行二抗孵育，TBST洗膜3次，每次10 min；将膜放在化学发光成像系统中，涂布均匀；化学发光成像系统曝光30/60 s，观察结果并保存图片。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 各组破骨细胞的形态观察

结果显示，与对照组比较，桃红四物汤组活跃的破骨细胞质内细胞核数量减少，TLR2组破骨细胞质内可以看到大量细胞核存在，而且体积显著增大，桃红四物汤+TLR2组与TLR2组对比，桃红四物汤+TLR2组破骨细胞质内细胞核数量减少，体积也明显减小。见图1。

图1 各组破骨细胞的形态（TRAP染色）

2.2 各组TLR2 mRNA的表达比较

见表1、图2。结果显示，与对照组相比，桃红四物汤组TLR2 mRNA 的表达显著下调（P＜0.05）；与对照组相比，TLR2 组的TLR2 mRNA 的表达显著上升（P＜0.01）；与桃红四物汤组比，TLR2 组、桃红四物汤+TLR2 组的TLR2 mRNA 的表达显著上升（P＜0.01）；与TLR2 组比，桃红四物汤+TLR2 组TLR2 mRNA 的表达显著下调（P＜0.01）。

表1 各组TLR2 mRNA及TLR2蛋白表达比较（±s）

表1 各组TLR2 mRNA及TLR2蛋白表达比较（±s）

注：与对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与桃红四物汤组比较，##P ＜0.01；与TLR2组比较，△△P ＜0.01。

TLR2蛋白0.996±0.045 0.480±0.045*2.583±0.057**1.523±0.135##△△组 别对照组桃红四物汤组TLR2组桃红四物汤+TLR2组n3333 TLR2 mRNA 1.002±0.069 0.584±0.053*3.405±0.119**1.701±0.162##△△

图2 各组TLR2蛋白条带

2.3 各组TLR2蛋白表达比较

见表1、图2。结果显示，与对照组相比，桃红四物汤组TLR2 蛋白的表达显著下调（P＜0.05）；与对照组相比，TLR2组的TLR2蛋白的表达显著上升（P＜0.01）；与桃红四物汤组比，TLR2 组、桃红四物汤+TLR2 组的TLR2 蛋白的表达显著上升（P＜0.01）；与TLR2 组比，桃红四物汤+TLR2 组TLR2 蛋白表达显著下调（P＜0.01）。

3 讨 论

骨或骨小梁的完整性或连续性遭到断裂称为骨折。骨折这一病名最早见于唐·王焘的《外台秘要》。骨折的原因主要分为内外两因，大多数骨折由外因导致。外因主要包括车祸、撞击等引起的直接暴力，也可由间接暴力、肌肉韧带忽然的剧烈牵引力、长期同一姿势等引起的劳损等引起。内因主要包括患者的年龄、骨质的结构等变化。如老年人因为年龄大，常易导致骨质疏松，可能打喷嚏就能发生脆性骨折。骨的正常生长和愈合主要是因为骨代谢的正常进行，骨化需要同时满足两个条件：一是需要正常的骨组织，这是骨化的必要条件；二是需要在软骨细胞的作用下才能进行，两者缺一不可。只有通过机体中的成骨细胞和破骨细胞的相互影响相互约束，才能维持骨代谢的正常进行［7］。随着中医药事业的不断进步，在骨折愈合方面中医药的治疗发挥着越来越大的作用，在骨损伤愈合的治疗上疗效突出，从古至今都是骨科方面的研究重点［8］。中医学认为骨折愈合主要包括第一阶段的瘀血消除，第二阶段新血的生成，最后阶段骨折的愈合。古代有许多医案、书籍记载了在骨伤科的治疗方面“活血化瘀”最为重要［9］。骨骼的生长和重建主要通过骨骼的血液供应。骨折后血液供应的质量直接影响骨骼愈合过程的快慢，并与其愈合有关。骨形成和骨重建与血管的生成息息相关［10］。传统中医理论认为一旦有骨折宜先运用活血化瘀的中药，血不活，则骨不能接［11］。

桃红四物汤主要功效是补血的同时能活血，兼有消肿止痛、去瘀生新的作用［12］。方中君药为桃仁、红花。桃仁有效成分为苦杏仁苷，而羟基红花黄色素A是红花中的主要成分，两者的主要作用是促进微循环，抑制血小板聚集，在活血化瘀中起关键作用，主要用于治疗骨折、痛经、骨质疏松、冠心病等疾病［13］。川芎中含有阿魏酸，具有抗炎、消肿等作用［14］。当归中含有藁本内酯，能够舒张血管，同样具有很好的活血化瘀作用［15］。研究发现，赤芍能够对血管的弹性进行改善，芍药苷是它的主要成分［16］。毛蕊花糖苷是生地黄的主要成分，它主要的作用是提高人体免疫、延缓衰老等［17］。整方合用，能够加快骨折愈合的速度。桃红四物汤主要通过改善血流变特性、促进HIF-1的分泌、加快骨折区域的血管新生、增加eNOS 和NO 及VEGF 的水平等［18］，为桃红四物汤对骨折的治疗提供了更加充分的理论支持。

骨折的愈合是一个十分复杂的过程，其本质是骨折端发生的骨重建和成形过程。通过破骨细胞和成骨细胞的相互作用来实现骨重建。成骨细胞和破骨细胞的共同参与完成骨组织代谢，为达到动态平衡，机体需通过骨形成和骨吸收之间的不断转化。电镜下可以看到，破骨细胞的褶皱膜上有许多结构完全不同的亚结构，这是破骨细胞行使骨吸收功能的保证，褶皱膜由于其不规则的表面而大大增加了各个亚结构之间的接触面积，这反过来又大大增加了破骨细胞骨吸收的面积，因此破骨细胞在骨折愈合的过程中起着至关重要的作用。

清·陈士铎《辨证录·接骨门》认为，摔伤后有大量瘀血存在体内，不能消散，血液不流通则瘀血不易散去，瘀血不去则骨折就难以愈合［19］。故治疗上应当运用攻利之法。人到老年，肝肾不足，筋骨衰弱，骨质疏松，瘀血证虽属实证，但多数虚中夹实，治疗上更应注意活血和养血相配合。桃红四物汤可使营血调和，补血不停滞，活血而不离经，在骨代谢中具有与成骨-破骨细胞耦合的动态平衡相同的作用，有利于动态调节OPG-RANKL-RANK 传导通路，有利于骨组织重建和恢复。TLRs 受体中包括TLR2，可通过在外周血白细胞的表面进行表达，也能激活NF-κB 和AP1 等转录因子，主要是因为它能与细菌和内源性配基发生相互作用，在4 号染色体4q32 区可以找到它的编码基因［20］。前期验证性实验中，用桃红四物汤处理实验小鼠，发现桃红四物汤在骨折愈合过程中的不同阶段可以抑制骨髓单核细胞中TLR2的表达。

本实验将RAW264.7 细胞随机分为对照组、桃红四物汤组、TLR2 组及桃红四物汤+TLR2 组，检测各组的TRAP 染色、qPCR 及WB，发现桃红四物汤通过抑制TLR2 的表达，使破骨细胞的分化受到抑制，进而使骨吸收的速度得到延缓，最终加快骨折愈合的进程。本研究发现桃红四物汤促进骨折愈合的分子机制，为我们开发新的骨折愈合治疗药物和干预方案提供一个潜在的切入点，也将中医的“活血化瘀”与“破骨细胞分化”理论结合起来，丰富了“活血化瘀”的现代内涵。