红壤中溶磷芽孢杆菌研究进展

林黎珍，任宗玲，王 佳，蔡燕飞

（华南农业大学资源环境学院，广州 510642）

中国红壤类土壤约为128 万km2，约占陆地总面积的13%，在国民经济的发展中占有重要地位［1-3］。中国红壤中度脱硅富铝，黏粒中游离铁占全铁的50%～60%，其黏土矿物以高岭石、赤铁矿为主，富含铁铝氧化物，其中铁铝氧化物的固磷能力很强，加上游离态铁铝的作用，将土壤中的磷酸根离子不断吸附在铁铝氧化物表面，形成一层氧化铁膜，封闭磷酸根与外界的作用，使固定的磷有效性较低［3，4］。在南方酸性红壤中，闭蓄态的磷可达60%以上［5］，造成磷肥利用率低，中国主要谷类作物磷的季节利用效率仅为11.6%［6］。

磷是作物生长必需的营养元素，是作物进行生理代谢的基础物质，参与植物体内各种生理生化活动，对促进农业生产力方面至关重要［7，8］。在土壤溶液中，植物吸收可溶性形式的磷，即正磷酸盐（HPO42-、H2PO4-），仅占土壤总磷的0.1%～0.5%（＜10 μmol/L）［9，10］。施用磷肥是解决土壤缺磷的主要方式，但长期施用化肥会加剧旱地红壤的酸化，降低土壤细菌多样性［11］。且施用的肥料中超过80%的磷会发生吸附或沉淀反应被固定，导致土壤中全磷含量增加，但土壤中磷素可利用率降低，施磷对作物的增产效果不显著，甚至可能会由于淋失或地表径流造成水体富营养化［5，12-14］。

溶磷微生物可以将土壤中难溶的磷素溶解，以供给植物吸收利用，此外还能分泌一些植物生长所需的生长激素，促进植物生长，从而减少化学磷肥的使用量［15-18］。溶磷微生物主要分为溶磷细菌和溶磷真菌，在土壤中，据估计有1%～50%的细菌和0.1%～0.5%的真菌具有溶磷效果［19］。其中芽孢杆菌在自然界中普遍存在，制成的菌剂具有营养简单、耐热、耐辐射、耐旱、性能稳定、繁殖快、保质期长、便于运输等特点［20］，能产多种抗菌物质和促进作物生长的激素等，是注册并商品化生产使用最多的微生物菌剂。国家化肥质量监督检验中心农业部肥料登记证公告显示，截至2020 年11 月，芽孢杆菌生物肥占已登记微生物肥的96.45%。Kour 等［19］综述了约551 种不同来源的溶磷菌，其中溶磷细菌中最占优势的属是芽孢杆菌属。针对红壤地区有效磷缺乏问题，本研究综述了溶磷芽孢杆菌对红壤中含磷矿物的研究情况，从有机酸、酶活性、基因工程等方面探究其对含磷矿物的溶解机制，以期为中国红壤地区磷素活化与利用提供理论支撑，为提高酸性红壤中磷的含量提供思路，对提高作物产量和科学使用磷矿资源具有重要意义。

1 溶磷芽孢杆菌的研究情况

自土壤中存在能够溶解难溶性磷的微生物提出以后，便开展了较多关于溶磷微生物的研究，前人研究的芽孢杆菌菌株溶磷情况见表1。

不同研究者从土壤中筛选分离出的芽孢杆菌对磷酸钙的溶磷量不同，对铝磷和铁磷溶解量的研究较少且溶磷量低于磷酸钙。王呈玉等［21］从玉米根际土壤中分离出具有溶磷-聚磷能力的阿氏芽孢杆菌XF1，以磷酸三钙、磷酸铝和磷酸铁为磷源的PVK培养基，溶磷量分别为891.60、205.42、27.17 mg/L，以磷酸钙为磷源时的溶磷量显著高于其他磷源，可能是菌株代谢物中的有机酸对Ca2+的螯合能力高于Fe3+和Al3+，以磷酸铝、磷酸铁和磷矿粉为磷源时，菌株溶解的磷很快又被发酵液中的Fe3+、Al3+及其他离子所固定，导致了以磷酸铝和磷酸铁为磷源的培养基中溶磷量显著低于以Ca2+为磷源的培养基［21］。溶磷芽孢杆菌还具有分泌铁载体、IAA、多种有机酸和脂类物质等的功能，可预防病害和促进作物生长。

2 芽孢杆菌溶磷机理

2.1 有机酸对无机磷的增溶作用

磷增溶涉及多种机制，其中有机酸作用是主要的溶磷机制，有机酸通过降低根际土壤的pH 或螯合磷酸盐中的阳离子，与磷争夺土壤上的吸附位点或与不溶性磷化合物相关的金属离子形成可溶性络合物，如铝、钙和铁的磷酸盐，使其转化为可溶形式，另外磷的溶解效果更多地取决于有机酸和磷源的质量而非数量，常见的有机酸包括天冬氨酸、柠檬酸、葡萄糖酸、乳酸、草酸和酒石酸等，这些有机酸在南方红壤上能与Fe、Al 和Ca 等金属离子间产生络合反应，显著促进Fe、Al 等离子的释放，从而降低土壤对磷的吸附［51-54］。Chawngthu 等［38］从农田土壤中筛选出10 株溶磷芽孢杆菌，其中蜡样芽孢杆菌MZLRPB6 有最大溶磷量，高效液相色谱分析显示在培养基上清液中有多种有机酸的产生，如葡萄糖酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、甲酸和乙酸等，通过分析不同溶磷菌对磷酸盐的增溶效果与有机酸生产、酸性磷酸酶活性间的关系，试验证实溶磷菌株的主要溶磷机制是产生有机酸。Do Carmo 等［55］筛选出一株巨大芽孢杆菌ATCC14581，试验证明该菌株产生有机酸使培养基pH 降低与溶解磷直接相关。Alemneh等从土壤中分离筛选出15 个溶磷细菌属，向培养基中添加色氨酸后培养基pH 下降，菌株的溶磷效果提高，得出菌株产生的有机酸如α-酮戊二酸、顺式乌头酸、柠檬酸、苹果酸和琥珀酸等可促进磷酸盐的溶解［56］。Kang 等［57］筛选分离出的溶磷巨大芽孢杆菌mj1212 通过分泌苹果酸和奎宁酸溶解磷酸盐。枯草芽孢杆菌BPM12 的pH 从最初的7.00 降至4.25，随着溶磷量的增加，pH 随之下降，在pH 为4.25 时，磷酸盐的最大增溶活性达到最大值。Wang 等［39］认为初步磷酸盐的增溶可能是pH 降低和有机酸产生联合作用的结果。此外，有研究也表明菌株产生的小分子有机酸导致培养基上清液酸化是磷酸盐溶解的主要原因［40，42］。吴海燕等［58］通过高效液相色谱法和傅里叶变换红外光谱分析仪对解磷巨大芽孢杆菌发酵液代谢产物进行分析，确定该菌通过分泌葡萄糖酸溶解磷酸钙。

2.2 其他代谢物质对无机磷的增溶作用

磷溶解与溶磷菌分泌有机酸致土壤pH 降低没有相关性，该菌的溶磷过程可能涉及其他机制，包括微生物细胞同化铵后释放质子、产生无机酸（即硫酸和硝酸）以及产生作用于两亲性脂肪物质的特定酶等机制［59］。此外，菌株的溶磷能力还与生长环境有关。有些溶磷菌在培养过程中通过呼吸代谢吸收NH4+，产生碳酸，由碳酸释放出的H+，导致培养基pH 下降，从而发挥溶磷作用［60］。王同等［61］从红壤茶园土中筛选出1 株溶磷效果较强的苏云金芽孢杆菌，在适宜条件下，其溶磷量为292.8 mg/L，在培养过程中能分泌草酸和苹果酸，但外加等量的草酸和苹果酸以及二者的混合液对磷酸盐的活化能力远低于菌株自身的溶磷能力，推断该溶磷菌还存在其他的溶磷机制。Rojas 等［50］从酸性土壤中筛选出的枯草芽孢杆菌UNB2 在以磷酸三钙为磷源的培养基中释放有机酸（葡萄糖酸、乳酸和柠檬酸等）的种类和数量均高于以铝磷和铁磷为磷源的培养基，其溶磷量也显著高于其余2 个培养基，但其溶磷量与有机酸的产量间没有显著差异，研究者认为溶磷量的差异除酸溶外，还与培养基中NH4+和磷酸盐的比表面积有关。杜慧慧等［25］研究发现，从不同根际土壤中筛出的41 株菌株发酵液上清液中pH 均有所下降，但增磷量最大的菌株其发酵液pH 并不是最低，表明发酵液pH 变化与溶磷量无显著相关性。骆韵涵等［62］从红树林酸性土壤中分离出一株短小芽孢杆菌，在该菌的上清液中检测到少量的葡萄糖酸，解磷量为90.79 mg/L，在固体培养上，短小芽孢杆菌发酵上清液和外加的等量有机酸并没有解磷圈出现，说明短小芽孢杆菌所产的有机酸并不能较好地溶解磷酸钙，其溶磷能力可能是通过其他代谢作用，如呼吸与同质化作用产生的质子、蛋白质等溶解部分磷酸钙的物质。

2.3 酶活性对有机磷的增溶作用

在土壤中，高分子量有机形式的磷不能被植物直接吸收，通常在矿化后转化为无机形式［63］。有机磷的矿化由不同的土壤酶催化，土壤中的磷酸酶能够水解磷酸酯和酸酐键，包括酸性和碱性磷酸酶、四磷酸腺苷酶、外切酶、磷蛋白磷酸酶、磷酸二酯酶、核苷酸酶、植酸酶和酸性磷酸单酯酶等，将土壤中的有机磷水解成无机形式，然后被植物根系利用和吸收［59，64，65］。此外，大多数植酸酶是催化P 从植酸中释放的高分子量酸性磷酸酶，植酸是一种肌醇酯，是种子和花粉中储存的主要P 形式［66，67］。土壤中的微生物通过生产植酸酶使植酸盐矿化和产生有机酸以溶解无机磷，从而提高作物对有机磷的利用［68］。江威等［69］分离的一株具有产磷酸酯酶和有机酸能力的溶磷菌YP6，用磷酸酯酶处理磷矿粉24 h 后，培养基中的有效磷显著增加，推断该解淀粉芽孢杆菌YP6 的主要溶磷机理为有机酸、植酸酶及磷酸酯酶的作用。

3 溶磷芽孢杆菌基因工程研究

多数细菌的溶磷能力与菌株产有机酸的能力相关，其中葡萄糖酸是最常见的磷酸盐溶剂，在吡咯喹啉醌（PQQ）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的作用下，形成葡萄糖酸。Islam 等［10］将地衣芽孢杆菌中编码PQQ的基因经体外扩增后在大肠杆菌中成功表达，接种大肠杆菌后，培养基pH 下降，有效磷含量提高，证实了PQQ 对磷酸盐增溶的作用。Huang 等［70］在巨大芽孢杆菌JX285 的基因组中也检测到编码PQQ 的基因pqq。Hanif等［71］无法使用通用引物扩增具有溶磷能力的枯草芽孢杆菌KPS-11 中的pqq基因，而扩增出编码植酸酶的基因bpp。江威等［69］从具有高溶磷能力的解淀粉芽孢杆菌YP6 中克隆出编码磷酸酯酶的基因AP3，并将其转入到大肠杆菌BL21 中，通过试验证实了AP3对磷矿粉的溶磷能力。利用分子生物学技术进行溶磷相关基因的研究，通过克隆溶磷相关基因明确其功能，丰富溶磷芽孢杆菌对难溶性磷酸盐溶解机制的认识，对提高溶磷菌的利用效率具有重要意义。

4 小结

溶磷芽孢杆菌是广泛存在于自然界中的重要微生物，可溶解难溶性磷酸盐以释放出可溶性磷供作物生长，特别是在南方酸性红壤地区，在减少化学磷肥施用、促进作物生长等方面具有重要作用。有关溶磷芽孢杆菌的溶磷机制主要集中于菌株分泌有机酸来溶解难溶性磷酸盐等研究方向，且不同芽孢杆菌的溶磷机制不同，未来可以从以下方面进行探索。

溶磷芽孢杆菌在不同环境下的溶磷效果具有差异性，南方红壤中以铁磷和铝磷为主，大部分菌株对磷酸铁和磷酸铝的溶解性都较低，有些菌株在酸性土壤中的定殖能力较差。此外，溶磷菌的丰度从富磷地区的2.0%到贫磷地区的22.1%，在贫磷土壤中存在选择压力，溶磷菌丰度更高，尽管丰度相对较高，但其总溶磷量较低，可以从红壤较肥的地区取土，增加以AlPO4、FePO4·4H2O 为无机磷源的培养基进行筛菌，选出对铁磷和铝磷溶解效果较好的菌株［72］。

已有大量研究将溶磷菌与其他菌株进行联合施用，其效果均优于菌株单独施用处理，但二者间的作用机理尚未明确，因此可将已有的菌株与其他菌株或土壤调理剂进行复配，并阐明二者及以上相互作用的机理，以提高菌种资源的利用率。

溶磷菌株的溶磷机理以产有机酸和提高土壤酶活性为主进行研究，有研究提到溶磷菌通过产有机酸与磷酸盐中的金属离子螯合，从而增加土壤中有效磷的含量，但其螯合机制尚未明确，在溶磷菌基因方面的研究较少，下一步应从螯合机制、基因组分析和其他方面探索溶磷菌的溶磷机制，为提高溶磷菌的效果提供更大空间。