五指山小型猪近交系不同世代个体外周血红细胞aGal表达水平测定研究*

冯书堂 李 莉 李国平 杨洁容 王太平

(北京盖兰德生物科技有限公司,北京 102206)

猪是人类异种器官移植理想供体,培育的五指山小型猪(Wuzhishan mini-pig,WZSP)近交系,较之普通猪具有四大应用优势[1-3]。但由于猪细胞表面上主要存在以aGal 为主的三种不同的、引起异种移植发生超急性免疫排斥反应的抗原,以及几乎所有猪品种基因组中含有PERV基因,是影响其在异种医用材料、异种移植研究和应用的主要障碍之一[4-5]。据文献报道[4],aGal基因存在所有品种猪基因组;西双版纳小型猪随着近交系数的增高,其外周血小板aGal表达量逐步减少,这就意味着随着近交繁育深入进行,有可能逐步延缓异种移植免疫排斥反应现象的发生。本研究拟以育成的WZSP近交系猪为材料[1,6-8],测定其不同近交世代个体和培育的近交系aGal/b4GalNT2双敲基因猪(以下简称:双敲基因猪)繁育的后代、外周血红细胞aGal表达量及变化规律[9],以及对aGal/b4GalNT2基因敲除猪繁育后代纯合子、杂合子分离结果的期待。为其异种医用生物材料等产品研究和应用,以及产品标准化、规模化生产提供科学依据。

目前,有关近交系猪红细胞aGal表达水平测定研究未见报道。因此,本研究结果对异种医用材料研究等有着重要的实用意义[4-5]。

1 材料和方法

1.1 材料

F19-28WZSP猪,共计55头[1,6],双敲基因修饰猪后代45头[9],实验组样品共计100头,并设对照组。实验组1:近交系F27-28共计26头;实验组2:近交系F248头;实验组3:近交系F19-21共计21头;实验组4:近交系双敲基因猪后代F1-3等待测定猪共计45头;对照组:未加IB4-FITC的红细胞。均由北京盖兰德生物技术有限公司提供,实验动物生产许可证号【SCXK(京)2020-0006】。

1.2 方法

1.2.1利用股隐动脉[1]:进行无菌采集血液,每头猪采血2～3 mL装入抗凝管。管上标注对应号码,注入血液之后马上轻柔快速翻转试管,保证血液不凝后放入保温箱。

1.2.2实验室红细胞分离方法:1)将采集的猪血置于抗凝管中,混合均匀备用;2)取分层的抗凝血下层红细胞1 mL,加入1 mL PBS重悬,然后将重悬后的红细胞缓慢加入3 mL GE Ficoll-Paque Plus中,20 ℃,300 r/min离心30 min;3)离心后溶液产生分层,下层为红细胞,将红细胞小心转移到新的15 mL离心管中,在离心管中加入10 mL PBS充分重悬红细胞,500 r/min 10 min离心后弃上清;4)重复步骤3,2～3次,然后对收集的红细胞进行计数;5)使用PBS稀释DBA(凝集素)至推荐浓度,按照说明书推荐用量孵育30 min;6)使用PBS洗涤,洗涤条件500 r/min 10 min;7)使用BD Ariana III流式荧光分选仪、上机测试;8)检测不同组合样品1 000个PBMC中,表达aGal的抗原阳性细胞数量的百分比(%)。

1.3 统计学分析

实验组与对照组之间的比较用t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 aGal抗原阳性细胞数量及表达量测定

F27出现2头aGal抗原阳性细胞数量的百分比极低个体,分别为16.2%和19.5%;组1与组3个体aGal抗原阳性细胞数量的平均值百分比差异有统计学意义(P<0.05)。

100头WZSP近交系不同世代、待测定的双敲基因修饰后代猪(含已测定GGTA1/b4GalNT2+hCD46+hCD55+hTBM五基因修饰纯合子猪)和对照组的测定结果见表1,2和图1,2。

图1 实验组与对照组外周血红细胞aGal表达水平Fig.1 The expression level of peripheral red blood cells in the experimental group and the control group was plotted

表1 近交系小型猪不同世代实验组与对照组aGal抗原阳性细胞测定结果Table 1 Determination of aGal expression level of peripheral red blood cells in pigs offspring of the Inbred mini-pig at the different generations

从图1可知,随着近交系代数提高,其个体红细胞aGal表达量逐步减低。

从图2可知,五基因修饰猪、双敲基因纯合子猪和近交系F20猪等部分实验组与对照组红细胞未发现aGal绿色的荧光反应,而实验组F20的D16号猪检测到其红细胞aGal具有较强的绿色荧光表达效果。

图2 部分实验组与对照组测定荧光反应检测图Fig.2 Detection chart of fluorescence reaction between some experimental groups and control groups

2.2 近交系各世代红细胞aGal免疫荧光检测

组1:近交系F27-2826头红细胞aGal免疫荧光反应百分率平均值为56.17%。其中低于50% 6头,占23.08%;50%～60% 8头,占30.77%;高于60% 的12头,占46.15%;其最低值16.2%,最高值86.2%。

组2:近交系F248头红细胞aGal细胞免疫荧光反应百分率平均值65.39%,其中低于50% 2头,占25%;50%～60% 2头,占25%;高于60% 4头,占50%,其最低值35.5%,最高值99.2%。

组3:F19-2121头红细胞aGal细胞免疫荧光反应百分率平均值为82.15%,其中低于50% 2头,占9.1%;50%～60% 6头,占28.57%;高于60% 13头,占61.91%;最低值38.8%、最高值89.4%。组1(56.17%)与组3(82.15%)的平均值差异有统计学意义(P<0.05)。

组4:其中8头GGTA1/b4GalNT2双敲基因猪繁育后代和1头已知为GGTA1/b4GalNT2+hCD46+hCD55+hTBM五基因修饰纯合子猪的红细胞aGal免疫荧光反应测定值为0.01%,其余aGal/b4GalNT2双敲基因猪繁育后代中,有2头测定值分别为0.02%、0.03%,有4头aGal免疫荧光反应数值高达52.67%～76.40%,其余28头测定平均值为31.03%(9.0%～49.2%)。

组5:对照组未加IB4-FITC的红细胞aGal免疫荧光反应测定值为0.01%。

3 讨论

实验组近交系各世代、双敲基因后代猪与对照组外周血红细胞aGal表达测定数据分析比较列为表1,2和图1,2。由图、表分析可以得出,近交系F27-28与F24个体红细胞aGal免疫荧光反应百分比,每代降低3.07%;F24与F20相比个体红细胞aGal免疫荧光反应百分比,每代降低了4.19%。尤其是F27已出现2头个体红细胞aGal免疫荧光反应百分比极低的个体(6.20%,19.50%)。表明,随近交系代数推进,其红细胞aGal细胞免疫荧光反应强度数值呈逐步下降趋势。其下降的比例略有差异(3.07%对4.19%),可能与采取实验样本数量不等有关。提示近交系猪从F19到F28随近交系数提高,其个体红细胞aGal免疫荧光反应呈现逐步下降趋势。尤其研究中发现:近交系F27中,同窝1对种猪红细胞aGal免疫荧光反应表达量极低,为今后培育近交系aGal低表达量的新品系奠定基础,也为培育新品系和应用提供科学依据。

由表2结果发现:双敲基因修饰猪后代3619、3018、3607 三头母猪和3608、3604、3608、3318、3020 五头公猪,共计8头猪与对照组红细胞aGal免疫荧光反应测定结果均为0.1%,与对照组取得一致性的结果,未发生aGal免疫荧光反应。因此,可视为aGal/b4GalNT2基因敲除纯合子个体;但有4头测定值分别为0.02%、0.03%的可视为近似aGal/b4GalNT2基因敲除纯合子个体;而有4头aGal免疫荧光反应数值高达52.67%～76.40%的个体,可视为配种后分离出来的非基因敲除猪个体;其中28头aGal免疫荧光反应平均数值为31.03%(9.0%～49.2%),可推测为双敲基因猪繁育的杂合子后代,其红细胞aGal免疫荧光反应比值均低于50%。上述研究结果证实的GGTA1/b4GalNT2基因敲除纯合子个体,可为其生物辅料产品提供一定的科学依据[9]。

表2 双敲基因猪实验组与对照组aGal抗原阳性红细胞测定结果Table 2 Determination of aGal expression level of peripheral red blood cells in pigs offspring of the knock gene heterozygous pigs

不同猪品种、同一猪品种不同个体以及同一个体、不同器官或细胞aGal的表达量不同;同一个体血细胞的aGal表达量血小板>粒细胞>单一核细胞>红细胞,血小板的aGal表达量是粒细胞的3倍,但不同猪个体相同血细胞的aGal表达量趋势之间无显著性差异[4]。因此,本研究首次利用aGal表达量最低的红细胞进行测定,取得的研究结果同样具有一定的参考价值。

近交系猪具有特异的分子遗传基础[10-15],有关小型猪近交系猪红细胞aGal表达水平测定研究尚未见报道,本研究测定数量有限,随近交系推进其个体aGal表达量,逐步降低机制有待深入研究。