基于UHPLC-QE-Orbitrap-MS技术的深加工槟榔籽的成分分析

马丹阳,高雪嫣,彭凌峰,伍少峰,王庆涛,郝智慧*

(1.中国农业大学三亚研究院,三亚 572025;2.中兽医药创新中心,中国农业大学动物医学院,北京 100193;3.新疆农业大学动物医学学院,乌鲁木齐 830052)

槟榔(Arecae Semen)作为我国著名的“四大南药”之首以及海南长期依赖的“三棵树”之一,为棕榈科植物槟榔(ArecacatechuL.)的干燥成熟种子,广泛分布于中国(海南、台湾等)、印度以及印度尼西亚等地[1]。它含有丰富的生物碱类、黄酮类、多酚类等多种化合物,临床上可用于球虫、绦虫以及食滞等疾病的治疗[2],除此之外,槟榔也具有悠久的食用历史[3]。随着槟榔全产业链的发展,商品槟榔给社会带来了巨大的经济效益,也为热带农业发展和农民增收提供有力保障,但其生产过程中产生的大量副产物,如槟榔籽(又称槟榔核,即槟榔加工后产生的干燥槟榔种子,呈红褐色)和槟榔蒂,这些副产物往往直接废弃,未被充分开发和利用,导致槟榔的营养价值和经济价值无法得到充分发挥,造成资源大量浪费[4]。研究发现,槟榔核具有抗菌、降糖和良好的抗氧化特性[5-7],还可部分替代普通栽培料来培养平菇[4],但其物质基础尚不明确,这在很大程度上限制了槟榔籽的进一步开发利用。

超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道肼高分辨质谱法(UHPLC-QE-Orbitrap-MS)具有高灵敏度、高精密度、快速获得化合物多级质谱信息等优势,可对未知成分进行快速、精确的确证,在中药复杂成分的鉴定和分析中发挥重要作用[8]。

因此,本研究基于UHPLC-QE-Orbitrap-MS技术,对深加工副产物槟榔籽进行成分鉴定,为综合利用槟榔深加工副产物提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Q Exactive Plus Orbitrap高分辨液质联用仪(Q Exactive Plus,Thermo Fisher),U3000超高效液相色谱及自动进样器(U3000,Thermo Fisher),ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1×100 mm,1.8 μm,Waters)涡旋混合器(Vortex-2 Genie,Scientific Industries),低温离心机(5810R,Eppendorf),超声波清洗器(WD-9415C,北京市六一仪器厂)。甲醇、乙腈、甲酸(色谱级,Thermo Fisher公司);去离子水(使用Milli Q Advantage A10超纯水机制备)。

1.2 样品

深加工槟榔籽来源于某公司两个地区的生产基地。使用粉碎机将干燥槟榔籽粉碎,过60目筛,即为待测样品。取待测样品粉末10 mg,加入1 mL 80%甲醇配制成10 mg·mL-1的样品溶液(含内标尼克地平5 μg·mL-1),超声10 min,14 000 r·min-1离心10 min,取上清液置入进样瓶中,待UHPLC-QE-Orbitrap-MS分析。

1.3 液相条件

色谱柱选用ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),柱温为35 ℃,进样体积为10 μL,流速为0.3 mL·min-1,以0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B)为流动相进行梯度洗脱,具体梯度洗脱条件如表1所示。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution condition %

1.4 质谱条件

采用Q Exactive Plus Orbitrap高分辨质谱进行质谱数据采集,检测模式为Full MS-ddMS2,正离子和负离子模式同时扫描,扫描范围为m/z100～1 200,MS1分辨率设置为70 000,MS2分辨率设置为17 500,离子源电压为3.2 kV,毛细管离子传输管温度320 ℃,辅助气加热温度350 ℃,鞘气流速40 L·min-1,辅助气流速15 L·min-1,AGC Target设置为1×106,TopN设置为5,触发MS2扫描的碰撞能量采用阶梯式碎裂电压NCE,设置为30、40和50。

1.5 化合物鉴定

采用Compound Discoverer 3.3软件进行原始数据特征峰提取,特征峰元素匹配、分子式预测及同位素分布匹配的质量偏差均设置为5 ppm以内。采用mzCloud在线数据库和本地自建mzVault中药天然产物数据库进行特征峰鉴定,阳性结果筛选标准为质量偏差<5 ppm、符合同位素分布及mzVault best match数据库匹配得分>70分。采用内标法对化合物相对含量进行计算。

2 结 果

2.1 深加工槟榔籽UHPLC-QE-Orbitrap-MS成分分析

根据设定的色谱和质谱条件,对两个生产基地的槟榔籽中的成分进行分析,获得负、正离子模式总离子流图(TIC图),见图1。借助Compound Discoverer 3.3软件对原始数据进行分析,采用本地数据库和mzCloud在线数据库对化合物进行结构鉴定。最终,在两个槟榔深加工基地共鉴定出槟榔籽相同成分85种,其中生物碱类化合物3种、黄酮类化合物24种、有机酸类化合物15种、酚类化合物7种、萜类化合物7种、氨基酸类化合物6种、糖类化合物4种、酯类化合物4种、酰胺类化合物2种、鞘脂类化合物2种、类固醇衍生物1种、苯丙素类化合物1种、香豆素类化合物1种以及其它8种。负、正离子扫描模式下得到的成分的保留时间、化合物名称、分子式、m/z、二级质谱碎片离子、相对含量、分类、分别见表2和表3。

图1 深加工槟榔籽负(A)、正(B)离子模式下的UHPLC-QE-Orbitrap-MS总离子流图Fig.1 Total chromatograms of seed of Areca catechu L. in deep processing by UHPLC-QE-Orbitrap-MS in negative (A) and positive (B) ion modes

表2 深加工槟榔籽负离子扫描模式的成分结构信息Table 2 Composition and structure information of seed of Areca catechu L. in deep processing in negative ion scanning mode

(续表2 Continued)

表3 深加工槟榔籽正离子扫描模式的成分结构信息Table 3 Composition and structure information of seed of Areca catechu L. in deep processing in positive ion scanning mode

(续表3 Continued)

2.2 深加工槟榔籽中主要成分的质谱裂解规律

2.2.1 生物碱类化合物 正离子扫描模式下共鉴别出生物碱类化合物3种,分别是化合物槟榔碱(9.851 4 μg·mL-1)、葫芦巴碱(3.014 0 μg·mL-1)和川芎嗪(0.089 4 μg·mL-1)。本研究以化合物葫芦巴碱为例,进行裂解规律分析。葫芦巴碱的准分子离子峰为m/z138.053 9 [M+H]+,同时可以观测4个特征离子碎片,分别是分子离子峰失去一个甲基再丢失一个氢的碎片离子峰(m/z122.525 7 [M+H-CH3-H]+)以及再失去一个羧基的碎片离子峰(m/z78.033 3 [M+H-CH3-H-COO-]+)。分子离子峰通过脱甲基脱氢(m/z122.525 7 [M+H-CH3-H]+)后,可再脱羰基,形成特征离子碎片(m/z94.064 4 [M+H-CH3-H-CO]+)。分子离子峰还可直接脱羰基形成特征离子碎片(m/z110.059 2 [M+H-CO]+)。根据正离子模式下的精确分子质量以及特征离子碎片信息,结合文献[11],判断该化合物为葫芦巴碱(其可能的裂解规律以及二级质谱图,如图2所示)。

图2 葫芦巴碱的质谱裂解规律(A)和二级质谱图(B)Fig.2 Mass spectrum cleavage of trigonelline (A) and secondary mass spectrum (B)

2.2.2 黄酮类化合物 正负离子扫描模式下共鉴别出黄酮类化合物24种,其中相对含量较高的黄酮类化合物有儿茶素(1.248 8μg·mL-1)、原花青素B1(0.557 7μg·mL-1)、原花青素B2(0.069 8μg·mL-1)以及异鼠李素-3-O-新橙皮苷(0.051 3μg·mL-1)。本研究以化合物儿茶素为例,进行裂解规律分析。化合物儿茶素的准分子离子峰为m/z289.069 7 [M-H]-,同时可以观测到分子离子峰分别失去C9H8O3、C9H8O4和CO2形成的碎片离子峰m/z125.023 4 [M-H-C9H8O3]-、m/z109.028 5 [M-H-C9H8O4]-和m/z245.080 0 [M-H-CO2]-。根据负离子模式下的精确分子质量以及特征离子碎片信息,结合文献[8],判断该化合物为儿茶素(其可能的裂解规律以及二级质谱图,如图3所示)。

图3 儿茶素的质谱裂解规律(A)和二级质谱图(B)Fig.3 Mass spectrum cleavage of catechin (A) and secondary mass spectrum (B)

2.2.3 有机酸类化合物 正负离子模式下共鉴别出有机酸类化合物15种,其中相对含量较高的有机酸类化合物有右旋奎宁酸(5.677 1 μg·mL-1)、L-苹果酸(1.921 3 μg·mL-1)和柠檬酸(1.010 8 μg·mL-1)。本研究以化合物柠檬酸为例,进行裂解规律分析。化合物柠檬酸的准分子离子峰为m/z191.018 3 [M-H]-,可以观测到分子离子峰依次失去H2O、H2O和CO2形成的碎片离子峰m/z173.007 6 [M-H-H2O]-、m/z154.997 5 [M-H-H2O-H2O]-和m/z111.007 9 [M-H-H2O-H2O-CO2]-。化合物柠檬酸的准分子离子峰失去C3H6O4形成的碎片离子峰m/z85.028 8 [M-H-C3H6O4]-。根据负离子模式下的精确分子质量以及特征离子碎片信息,结合文献[10],判断该化合物为柠檬酸(其可能的裂解规律以及二级质谱图,如图4所示)。

图4 柠檬酸的质谱裂解规律(A)和二级质谱图(B)Fig.4 Mass spectrum cleavage of citric acid (A) and secondary mass spectrum (B)

2.2.4 氨基酸类化合物 正负离子模式下共鉴别出氨基酸类化合物6种,其中相对含量较高的氨基酸类化合物为L-苯丙氨酸(0.952 2 μg·mL-1)和L-谷氨酸(0.109 7 μg·mL-1)。本研究以L-苯丙氨酸为例,进行裂解规律分析。L-苯丙氨酸的准分子离子峰为m/z166.085 1 [M+H]+,经过脱羧可以观测碎片离子峰m/z120.079 9 [M+H-COOH]-。分子离子峰也可分别脱氨基和羧基形成碎片离子峰m/z149.058 8 [M+H-NH3]-和m/z103.053 4 [M+H-NH3-COOH]-。根据正离子扫描模式下的精确分子质量以及特征离子碎片信息,结合文献[10],判断该化合物为L-苯丙氨酸(其可能的裂解规律以及二级质谱图,如图5所示)。

图5 L-苯丙氨酸的质谱裂解规律(A)和二级质谱图(B)Fig.5 Mass spectrum cleavage of L-Phenylalanine (A) and secondary mass spectrum (B)

2.2.5 糖类化合物 正负离子模式下共鉴别出糖类化合物4种,分别是D-果糖(0.171 6 μg·mL-1)海藻糖(0.629 4 μg·mL-1)、葡糖胺(0.095 6 μg·mL-1)以及棉籽糖(0.003 0 μg·mL-1)。本研究以化合物海藻糖为例,进行裂解规律分析。化合物海藻糖的准分子离子峰为m/z341.104 4 [M-H]-,同时可以观测到分子离子峰依次失去CH3O、C8H13O7形成的碎片离子峰m/z89.023 7 [M-H-CH3O-C8H13O7]-,以及再失去H2O形成的碎片离子峰m/z71.013 2 [M-H-CH3O-C8H13O7-H2O]-。此外还观测到了m/z113.023 5 [M-H-C7H10O7-2 H-H2O-2 H]-,m/z101.023 6 [M-H-C4H8O4-C4H8O4]-,m/z161.043 8 [M-H-C6H12O6]-,m/z143.033 5 [M-H-C6H12O6-H2O]-和m/z179.054 3 [M-H-C6H10O5]-的特征碎片离子峰。根据负离子模式下的精确分子质量以及特征离子碎片信息,结合文献[12],判断该化合物为海藻糖(其可能的裂解规律以及二级质谱图,如图6所示)。

图6 海藻糖的质谱裂解规律(A)和二级质谱图(B)Fig.6 Mass spectrum cleavage of α,α-Trehalose (A) and secondary mass spectrum (B)

2.2.6 香豆素类化合物 正离子模式下共鉴别出香豆素类化合物甲氧基香豆素,其相对含量为0.009 2 μg·mL-1。其准分子离子峰为m/z177.053 3 [M-H]-,同时可以观测到分子离子峰依次失去CO2、脱氢、脱甲基形成的碎片离子峰m/z117.032 6 [M-H-CO2-H-CH3]-,继续脱羰基形成的碎片离子峰m/z89.037 8 [M-H-CO2-H-CH3-CO]-。分子离子峰分别失去OCH4和羰基形成m/z145.027 3 [M-H-OCH4]-和m/z149.058 6 [M-H-CO]-的碎片离子峰。分子离子峰还可以分别脱羰基、脱甲基和加氢形成碎片离子峰m/z135.043 3 [M-H-CO-CH3+H]-,随后脱氢形成m/z134.035 2 [M-H-CO-CH3+H-H]-的碎片离子峰,再失去羟基形成碎片离子峰m/z117.032 6 [M-H-CO-CH3+H-H-OH]-。根据正离子模式下的精确分子质量以及特征离子碎片信息,结合文献[11],判断该化合物为甲氧基香豆素(其可能的裂解规律以及二级质谱图,如图7所示)。

图7 甲氧基香豆素的质谱裂解规律(A)和二级质谱图(B)Fig.7 Mass spectrum cleavage of 7-Methoxycoumarin (A) and secondary mass spectrum (B)

3 讨 论

槟榔作为“四大南药”之首,具有抗寄生虫、抗炎、抗氧化、抗菌等多种药理活性,目前已有文献对槟榔籽不同萃取部位的成分进行研究[7,29],但对深加工副产物槟榔籽成分的系统研究鲜有报道,这在很大程度上制约了它的进一步发展。因此,本试验利用UHPLC-QE-Orbitrap-MS技术对深加工槟榔籽中的成分进行分析,最终鉴定出化合物85个,其中包括生物碱类、黄酮类、有机酸类、酚类、萜类、氨基酸类、糖类、酯类、酰胺类、鞘脂类、类固醇、苯丙素类、香豆素类等化合物,其中58种化合物在槟榔籽中首次被报道(除L-谷氨酸、右旋奎宁酸、葫芦巴碱、3-哌啶甲酸、富马酸、马来酸、棉籽糖、柠檬酸、槟榔碱、L-酪氨酸、5-羟甲基糠醛、糖精、原花青素B1、尼泊金乙酯、原花青素B2、对羟基苯甲酸、儿茶素、3,4-二羟基苯甲醛、芦丁、异牡荆素、异鼠李素、二氢槲皮素、槲皮素、纽甜、柚皮素、川陈皮素、亚麻酸外),进一步探明了槟榔籽的化学成分。此外,还发现了甜味剂糖精、纽甜、甜菊糖苷和甜菊双糖苷,以及防腐保鲜剂尼泊金乙酯等。

以槟榔碱为主的生物碱被认为是槟榔中的主要活性物质[2]。据报道,槟榔碱具有广泛的药理活性,包括对神经、心血管、内分泌和消化系统影响,以及抗寄生虫和抗菌的作用,槟榔碱可通过麻痹虫体、致使虫体失去活动能力,发挥驱虫作用,槟榔碱还可对变形杆菌、白色念珠菌和炭疽杆菌具有抑制作用[30]。葫芦巴碱具有神经保护作用[31],也可通过抗炎、抗氧化、抗凋亡机制发挥对胃溃疡的保护作用[32]。由于槟榔碱和葫芦巴碱具有相似的化学结构,有研究推测槟榔碱是由葫芦巴碱衍生而来的[33],这也可能是两种生物碱含量较多的原因。其次,深加工槟榔籽中还含有较多的黄酮类和有机酸类化合物,如原花青素B1、原花青素B2、儿茶素、柠檬酸等。原花青素B2具有抑制氧化应激、缓解炎症、神经保护等多种药理活性[34],可通过靶向NF-κB、NLRP3和TLR4等信号通路,调节多种炎症介质的表达,还可通过维持氧化还原平衡和减轻细胞凋亡从而缓解胃肠道疾病[35]。儿茶素可通过改变NF-κB、Nrf-2、TLR4/NF-κB、COMT和MAPKs通路发挥抗炎、抗糖尿病、抗癌、神经保护、杀菌、增强记忆、抗关节炎和保护肝的作用[36]。在饲料中添加柠檬酸可改善适口性,增强动物食欲,提高畜禽采食量,同时对维持畜禽消化道中微生物菌群的平衡也起到促进作用[37]。

4 结 论

本研究采用UHPLC-QE-Orbitrap-MS技术首次对深加工副产物槟榔籽成分进行系统分析,为阐明槟榔籽物质基础提供科学数据参考。研究发现深加工副产物槟榔籽中含有多种成分,提示具有潜在的驱虫、抗菌、抗氧化、抗炎和神经保护等作用,有望在饲料添加剂、开发抗氧化剂、驱虫等多领域开展应用研究,槟榔产业发展提供新的思路。