1p36与12q24隐匿性易位致多发畸形胎儿的遗传学分析

林俊生, 叶怡虹, 卢娉霞, 胡倩, 叶婷婷, 陈加弟, 曹颖平

遗传学因素是导致先天畸形的重要因素之一[1-2]。临床上对于先天畸形的遗传学检测方法主要有常规核型分析(conventional cytogenetic analysis, CCA)、单核苷酸多态性微阵列(single nucleotide polymorphism microarray, SNP)分析和荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization, FISH)技术。CCA虽然能够分析全部染色体,但其只能检测大片段异常(>10 Mb),无法检测小片段的插入、倒位、微缺失和微重复,而且对于区带相似、片段大小相近的大片段染色体隐匿性易位也不易检出[3]。SNP技术作为CCA的重要补充,可以检测CCA难以检测出的染色体微缺失和微重复,但是无法检测平衡易位。FISH技术虽然能够检测平衡易位,尤其是隐匿性易位,但是只能分析已知序列的染色体异常,无法实现全基因组检测。本研究联合CCA、SNP和FISH技术对携带有罕见隐匿性染色体异常的胎儿进行遗传学分析,并为父母再生育提供遗传咨询。

1 资料与方法

1.1 一般资料 胎儿母亲年龄28岁,2019年3月孕16周左右胚胎停育。本次妊娠为宫内单胎妊娠,因胎儿超声异常于19周行产前诊断。孕19+6周三维超声提示,胎儿脑积水、脐静脉走行异常(持续性右脐静脉?)、心肌回声稍增强、局部肠管回声稍增强;孕22+3周三维超声提示,胎儿各生长径线测值均小于相应孕周,存在胎儿脑积水、复杂心脏畸形(室间隔缺损、主动脉增宽骑跨、肺动脉狭窄——法洛四联症?)、永存左上腔静脉、持续性右脐静脉、双侧肾盂分离、脐带绕颈。胎儿父母为非近亲婚配。本研究经笔者医院伦理委员会批准(2023KY200)。

1.2 方法

1.2.1 试剂和仪器 羊水细胞培养基(BM1013-10,杭州宝荣科技有限公司);FISH探针试剂盒(S500-24,美国雅培公司);QIAamp DNA Mini Kit(51304,德国 QIAGEN公司);CytoScanTMHD芯片及试剂盒(901859,美国Affmetrix公司)。实时荧光定量PCR扩增仪(7900,美国ABI公司);分光光度计(NanoDrop 2000/2000c)和GeneChipTM杂交炉(Applied Biosystems)(美国赛默飞公司);基因芯片全自动洗涤工作站(Affymetrix 7G)和高分辨率芯片扫描仪(Affymetrix Genechip Scanner 3000)(美国 Affmetrix公司)。

1.2.2 显带核型分析技术检测染色体核型 抽取羊水及胎儿父母外周血,按照常规方法制备染色体,利用G显带技术进行显带。利用Cytoversion软件(LeicaGSL120,德国莱卡公司)进行分析,按照人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN2018)进行描述。

1.2.3 SNP检测 提取羊水细胞及父母外周血核酸,进行SNP测序操作,并利用DECIPHER数据库、在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)和美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)等在线数据库对异常染色体进行分析,并判读结果。

1.2.4 中期FISH技术检测 根据操作手册,分别利用FISH探针进行杂交和检测,其中1号和12号短臂末端信号均为绿色,长臂末端信号均为红色。

2 结 果

2.1 CCA结果 CCA检测结果显示,胎儿、母亲和父亲均未见染色体异常(图1)。

A：胎儿染色体核型分析结果为46,XX;B：母亲染色体核型分析结果为46,XX;C：父亲染色体核型分析结果为46,XY。

2.2 SNP分析结果 胎儿SNP检测结果：arr[hg19]Xp22.12(20,212,014-20,718,134)x3, 1p36.33p36.13 (849,466-16,724,642)x1, 12q24.31q24.33 (122,915,078-133,777,562) x3,提示本例为Xp22.12(506.1 kb)片段重复、1p36.33p36.13缺失和12q24.31q24.33重复的胎儿。Xp22.12区段含有RPS6KA3(300075) 基因部分片段(图2A),1p36.33p36.13内含GABRD(137163)、PRDM16 (605557)和SKI(164780)等147个OMIM基因(图2B),12q24.31q24.33区段内含PUS1 (608109)和ANKLE2 (616062)等56个OMIM基因(图2C)。母亲SNP结果正常。父亲SNP结果显示,Xp22.12(506.1 kb)片段重复,与胎儿X染色体SNP检测结果一致,但父亲无临床表型,提示该片段重复不是胎儿超声畸形的遗传因素。1p36.33p36.13缺失和12q24.31q24.33重复可能是由于父母一方携带t(1;12)(1p36.13;12q24.31)所致。

SNP：单核苷酸多态性微阵列。A：X染色体重复,Xp22.12存在506.1 kb重复;B：1号染色体缺失,1p36.33p36.13区段存在15.8 Mb片段缺失;C：12号染色体重复,12q24.31q24.33区段存在10.8 Mb片段重复。

2.3 FISH技术检测结果 胎儿羊水中期FISH检测结果显示：2条12号染色体均正常;2条1号染色体中,1条正常,1条为衍生染色体,为ish der(1)t(1;12)(12q+,1q+),即1号染色体于1p36.13断裂丢失,并连接上来自于12号染色体12q24.31q24.33片段(图3A、B)。母亲外周血中期FISH检测结果显示：ish t(1;12)(12q+,1q+;12p+,1p+)(图3C、D)。父亲FISH检测结果为正常(图3E、F)。

FISH：荧光原位杂交。A、B：胎儿FISH结果为ish der(1)t(1;12)(12q+,1q+)(红色箭头所指为异常染色体);C、D：母亲FISH结果为ish t(1;12)(12q+,1q+;12p+,1p+)(红色箭头所指为异常染色体);E、F：胎儿父亲FISH检测结果未见异常。

2.4 遗传咨询 综合CCA、SNP技术和FISH检测结果,明确胎儿核型为46,XX, der(1)t(1;12)(1p36.13;12q24.31);母亲核型为46,XX, t(1;12)(1p36.13;12q24.31);父亲核型为46,XY。结合胎儿超声检查结果异常,孕妇及家属选择终止妊娠。经医院伦理委员会讨论,于妊娠28周时进行引产。

3 讨 论

CCA虽然是胎儿染色体疾病产前诊断的“金标准”,但其无法检测微缺失、微重复以及隐匿性染色体相互易位[4-5]。隐匿性染色体相互易位指在光学显微镜下无法辨认的微小或条带相似的染色体片段的易位[6]。联合SNP和FISH技术可以检测CCA不易检测的染色体隐匿性易位,为患者提供更为全面和准确的产前遗传学诊断。本次研究联合CCA、SNP和FISH技术对该多发畸形胎儿进行遗传学产前诊断。

胎儿CCA分析结果显示,未见染色体异常,但是超声显示胎儿为多发畸形。SNP结果为Xp22.12重复(506.1 kb)、1p36.33p36.13缺失(15.8 Mb)和12q24.31q24.33重复(10.8 Mb),提示胎儿父母之一可能为1号和12号染色体易位的携带者。FISH结果明确胎儿遗传了因母亲携带隐匿性易位形成的衍生1号染色体der(1)t(1;12)(1p36.13;12q24.31)。相互易位的片段均大于10 Mb,理论上利用CCA可检测出来,但是由于1p36.33p36.13和12q24.31q24.33的G显带带纹均为浅带,很相似,两者的易位使用CCA技术难以检测。本次联合应用CCA、SNP和FISH技术,成功诊断出携带有隐匿性染色体变化的胎儿。CCA结果父亲为46,XY,母亲为46,XX,FISH检测发现,母亲存在隐匿性易位,胎儿母亲理论上在减数分裂会形成18种配子,生育正常胎儿为1/18,生育表型正常的携带者概率为1/18,其余16/18均为染色体不平衡易位。因此该母亲再次妊娠时,应进行遗传学咨询。

胎儿Xp22.12发生506.1 kb的重复,内含RPS6KA3基因的部分片段,该基因突变与X染色体连锁显性遗传的Coffin-Lowry综合征等疾病相关[7-8],但该片段重复与胎儿的临床表型是否相关尚不明确。父母SNP结果显示,该片段遗传自父亲,父亲无异常表型,推测Xp22.12发生506.1 kb的重复不是胎儿致畸的遗传学因素。

胎儿在1p36.33p36.13发生15.8 Mb片段的缺失,内含GABRD、PRDM16、SKI等147个OMIM基因,通过数据库分析,提示1p36.33p36.13为致病性,主要涉及1p36缺失综合征,又称为1p36单体[9]。1p36缺失综合征是最常见的染色体亚端粒区域微缺失,在活产新生儿中发病率约为1/5 000,于1980年由HAIN等[10]首次报道。SHAPIRA等[11]发现,1p36缺失综合征患者具有典型的临床表型：面容异常、前囟闭合延迟、细发丝、内眦赘皮、短指/先天性指屈曲、短足、身材矮小、不同程度的发育迟缓和智力障碍等。季修庆等[12]和刘慧丽等[13]也发现,1p36缺失综合征具有典型面容特征、智力障碍,尤其是语言发育落后和矮小等特点。

胎儿在12q24.31q24.33发生10.8 Mb片段的重复,内含PUS1和ANKLE2等56个OMIM基因。12号染色体长臂末端部分三体综合征是一种非常罕见的染色体异常。李红妩[14]报道1例12q24三体胎儿存在先天畸形,出生后14 d死亡。数据库分析显示,PUS1基因纯合突变与常染色体隐性遗传的乳酸酸中毒性肌病并铁粒幼细胞贫血1型疾病相关,临床表型包括生长发育异常、小头畸形、肌无力和智力障碍等[15]。ANKLE2基因纯合或复合杂合突变与常染色体隐性遗传的原发性小头畸形16型疾病相关,临床表型包括身材矮小、小头畸形、上睑下垂以及隐睾症等[16]。胎儿孕20周三维彩超结果显示,胎儿双侧侧脑室扩张(1.4 cm)、持续性右脐静脉、心肌回声稍增强、局部肠管回声稍增强,可能与1p末端缺失和12q末端重复有关。

综上所述,本研究通过联合应用CCA、SNP和FISH技术,对携带有隐匿性易位导致胎儿染色体发生隐匿性结构异常的患者进行分析,明确了CCA和SNP结果不一致的原因,以及1p36.33p36.13缺失(15.8 Mb)和12q24.31q24.33重复(10.8 Mb)是该胎儿畸形的遗传学病因。因此,产前诊断时应用多种遗传学诊断技术进行综合判断,可为临床提供更准确的遗传信息,有利于遗传缺陷胎儿的诊断。