化瘀止血胶囊的薄层鉴别及急性毒性实验研究

2024-01-09谢嘉驰罗黎霞罗纯清杨宁

中国民族民间医药·下半月 2023年11期

关键词：延胡索化瘀薄层

谢嘉驰罗黎霞罗纯清杨宁

基金项目：

2020年湘潭市医学科研项目（2020xtyx-47）。

作者简介：

谢嘉驰（1990—），女，汉族，硕士，主管中药师，研究方向为中药成分分析及质量检测。E-mail：784970867@qq.com

通信作者：

杨宁（1980—），男，汉族，本科，主管中药师，研究方向为中药鉴定分析。E-mail：505483231@qq.com

【摘要】

目的：建立化瘀止血胶囊的薄层鉴别方法，并探讨其口服用药安全性。方法：采用薄层鉴别方法对处方中三七、延胡索进行定性鉴别，采用ICR小鼠经口灌服最大给药量，进行急性毒性实验。结果：薄层鉴别分离度效果好，专属性强；在最大给药量10.0 g生药/kg情况下，小鼠无明显的自主活动异常、未见相关毒性反应以及死亡现象。与空白对照组相比，在给药当天、给药前、给药后第7天、第14天小鼠体重无明显差异。结论：薄层鉴别操作简单、方便可行，可作为该制剂质量控制方法之一，且此剂量下口服用药安全可靠。

【关键词】

化瘀止血胶囊；薄层色谱法；急性毒性实验；用药安全

【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2023）22-0015-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.22.zgmzmjyyzz202322005

TLC Identification and Acute Toxicity Assay of Huayu Zhixue Capsules

XIE Jiachi LUO Lixia LUO Chunqing YANG Ning*

Department of Pharmacy， Xiangtan Hospital of Traditional Chinese Medicine，Xiangtan 411100，China

Abstract：

Objective To establish a thin layer identification method for Huayu Zhixue Capsule and to explore its safety in oral administration. Methods The thin layer identification method was used to qualitatively identify Panax notoginseng and Corydalis yanhusata in the prescription. The maximum dosage of ICR mice was used for acute toxicity test. Results The thin layer identification was effective and specific. Under the maximum dose of 10.0 g crude drug/kg， no obvious abnormal autonomic activity， related toxic reactions and death were observed in mice. Compared with blank control group， there was no significant difference in body weight on the day of administration， before administration， 7d and 14d after administration. Conclusion Thin layer identification is simple， convenient and feasible， and can be used as one of the quality control methods of this preparation.

Keywords：

Huayu Zhixue Capsules; Thin Layer Chromatography; Acute Toxicity Test; Drug Safety

化瘀止血胶囊处方来源于我院医生的长期临床实践总结，并以协定处方的形式在院内使用多年。由三七、白及、蒲黄炭、延胡索四味药组成，具有化瘀止血、消肿定痛功效，临床上治疗胃出血疾病效果显著。为解决汤剂给临床用药带来的不便，我院按照相关技术原则将其开发成院内制剂——化瘀止血胶囊。本课题组前期已对大鼠胃出血模型进行了临床实验研究，结果显示化瘀止血胶囊具有良好的疗效。

此外，查阅国内文献，发现三七制剂可能引发胃肠道刺激［1］、出血、过敏反应［2］，其中以皮肤损害最为常见［3］；延胡索制剂可致严重药物性肝损伤［4-6］，这些制剂的不良反应是影响临床安全用药的重要因素。因此，为控制该制剂产品质量，保证临床疗效和安全用药，本课题对三七、延胡索进行了薄层色谱鉴别，并参照《药物单次给药毒性研究技术指导原则》的相关规定［7］，采用大鼠急性毒性试验探讨其安全性［8-9］，为该制剂的质量控制及临床用药安全提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 PL2001-L型電子天平（上海甄明科学仪器有限公司）；SKG-01型电热恒温鼓风干燥箱（湖北省黄石市恒丰医疗器械有限公司）；DS-0405超声波清洗机（深圳品凰科技有限公司）；CX23LEDRFSIC显微镜［奥林巴斯（中国）有限公司］，CP214型电子天平（美国Ohaus公司）；ZF-2型三用紫外仪（上海市安亭电子仪器厂）。

1.2 材料三七对照药材（批号：120941-201108）、延胡索对照药材（批号：120928-201311）由中国食品药品检定研究院提供。化瘀止血胶囊（湘潭市中医医院制剂室，批号：20131201）；羧甲基纤维素钠（上海山浦化工有限公司，批号：20141201）；甲醇（天津科赛欧，批号：200304）；甲苯（国药集团，批号：20180111）；乙酸乙酯（批号：20181129）、二氯甲烷（批号：20201212），均购自于广东光华科技有限公司；正丁醇（批号：20220305）、乙醚（批号：20220319）、丙酮（批号：20190105），均购自于天津富宇精细化工有限公司，以上试剂均为分析纯。

1.3 动物 SPF级雌雄各半的费城癌症研究所（简称：ICR）小鼠各20只，小鼠重量：18.0～20.0 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，试验动物生产许可证号：SCXK（湘）2013-0004。动物实验室温度：20～26℃，动物实验室湿度：40%～70%，换气次数：≥15次/h，动物试验流程及相关操作遵守《实验动物管理条例》。

2 方法与结果

2.1 三七的薄层鉴别取内容物5 g，加40mL甲醇，超声30min，过滤，滤液蒸干，加水20mL使残渣溶解，每次用20mL水饱和的正丁醇萃取，萃取3次，将正丁醇液合并，用20mL氨试液洗涤，再用20mL饱和的水正丁醇洗涤，洗涤2次，将正丁醇液蒸干，残渣加1mL甲醇溶解，即为供试品溶液。另取缺三七阴性样品，同法制成缺三七阴性样品溶液。再取三七对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。照2015版《中国药典》（四部通则0502）试验，分别吸取4μL的供试品、阴性样品、对照药材溶液，点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）的下层溶液为展开剂，10℃以下放置2 h，展开，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性无干扰。如图1所示。

2.2 延胡索的薄层鉴别取内容物10g，研细，加50mL甲醇，超声30min，过滤，滤液蒸干，加10mL水使残渣溶解，加浓氨试液调至碱性，用10mL乙醚振摇萃取，萃取3次，将乙醚液合并，蒸干，加1mL甲醇使残渣溶解，即为供试品溶液。另取缺延胡索阴性样品，同法制成缺延胡索的阴性样品溶液。再取延胡索对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。照2015版《中国药典》（四部通则0502）试验，分别吸取上5μL的供试品、阴性样品、对照药材溶液，点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮（9∶2）为展开剂，展开，晾干，再置于碘缸中约3min取出，将板上吸附的碘挥尽后，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性无干扰。如图2所示。

2.3 小鼠急性毒性试验［10-18］

2.3.1 最大给药量实验将雌雄各20只SPF级ICR的小鼠按性别、体重随机方法分为两组，即为空白对照组和化瘀止血胶囊组。实验前禁食12 h以上，按40mL/kg剂量经口灌胃分别给予空白对照品组和化瘀止血胶囊组，给药当日给药2次，间隔6 h，化瘀止血胶囊组累积剂量为10.0 g生药/kg，具体试验剂量及分组情况见表1。给药当天，尤其在给药后0～4 h内密切观察并记录各组小鼠一般活动状况、中毒表现和特点、毒性反应出现及恢复时间以及死亡情况等。然后每天观察1次，连续观察14 d。分别于给药前及给药后第7天、第14天，使用电子天平对小鼠体重进行称量。所有小鼠在试验结束后腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉处死，并予以大体解剖，肉眼观察各脏器的位置、大小、色泽、粘连等情况，并检查脏器表面和切面的质地、积液及肿瘤等异常改变。在试验过程中若有非计划死亡的动物（包括濒死动物），均应进行大体解剖。

2.3.2 统计学分析采用SPSS 16.0软件，体重采用均数加减标准差（x±s）两组间比较满足正态性和方差齐性时采用t检验，否则采用Mann—Whitney Test，以P＜0.05表示差异具有统计学意义；P＜0.01表示差异其有显著性意义。

2.3.3 结果

2.3.3.1 一般活動状况及死亡情况在灌胃给药后0～4 h内和连续14 d观察期间，空白对照组和化瘀止血胶囊组小鼠自主活动如常，未见明显异常和死亡现象。

2.3.3.2 体重变化情况分别于给药前、给药后第7天和第14天称重，结果与空白对照组比较，化瘀止血胶囊组小鼠体重变化无显著性差异，且体重在正常增长范围内，说明ICR小鼠经口灌服化瘀止血胶囊，给药当日给药2次，累积剂量10.0生药/kg，对小鼠体重增长无明显影响。具体见表2、表3、表4。

2.3.3.3 大体解剖检查结果肉眼观察各脏器表面和切面均未见明显异常情况。

3 讨论

化瘀止血胶囊方中三七化瘀止血、活血止痛，为君药；白及收敛止血、消肿生肌，止血同时促进恢复，延胡索活血、行气、止痛，两者配合三七化瘀止血，行气止痛，为臣药；蒲黄止血、化瘀，调血而兼止，为佐药。诸药合并，化瘀止血、消肿定痛。根据湖南省药品监督管理局《湖南省医疗机构应用传统工艺配制中药制剂备案管理实施细则》的规定，薄层鉴别应首选处方中君臣药。故采用TLC法鉴别化瘀止血胶囊中三七、白及、延胡索药味，建立其TLC色谱方法学研究。

在三七的薄层鉴别试验中，参考《中国药典》2015版一部，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）为展开剂，结果发现该展开剂中三氯甲烷毒性大。后经查阅文献，选用二氯甲烷代替三氯甲烷为展开剂进行试验，结果显示斑点清晰，专属性强，且展开剂毒性降低，故纳入质量标准。在延胡索的薄层鉴别试验中，选用延胡索对照药材作为对照，结果显示，与对照品色谱相应的位置上，主斑点明显，故纳入质量标准。处方中白及薄层分离效果差，且阴性干扰严重，故未列入质量控制标准。因此，将三七、延胡索列入质量标准。经试验，该方法操作簡便、准确度高、重复性好、专属性强。

本课题组在前期已对化瘀止血胶囊的止血治疗作用进行了研究，显示对胃出血其具有较好的治疗作用。在肯定其疗效的前提下，对该制剂的安全性进行评价。结果在本试验条件下，ICR小鼠经口灌胃给予化瘀止血胶囊（0.125 g生药/mL），最大剂量40mL/kg，每天给药2次（累积剂量为10.0 ｇ生药/kg），对其一般活动状况和体重量增长无明显影响，未见明显急性毒性反应。根据《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》［10］，计算出小鼠最大给药量相当于70 kg成人临床拟用量的130倍，提示化瘀止血胶囊口服用药安全性较高，可为临床应用安全性提供依据。

参考文献

［1］

孟祥云，曹荣娟，叶茜，等. 256例中药不良反应报告分析［J］. 中医药临床杂志，2019，31（10）：1853-1856.

［2］陈新彤，黄胜男，庄伟，等. 三七用药咨询常见问题分析［J］. 北京中医药， 2019， 38（3）：284-286.

［3］赖玲，付鹏钰. 153例含三七成方制剂不良反应分析［J］. 海峡药学， 2020， 32 （9）： 205-208.

［4］杨瑞华，李芹.复方枣仁胶囊致肝损害1例［J］. 内蒙古中医药，2014，33（13）：83.

［5］蒋蒙，陈尚军，谢虎生.可达灵致肝损害1例［J］. 人民军医，2016，59（1）：40.

［6］李艳华，翟丽杰，肖芳，等. 复方元胡制剂致严重药物性肝损伤2例的警示［J］. 药学与临床研究，2016，24（5）：404-406.

［7］黄芳华，王庆利.《药物单次给药毒性研究技术指导原则》解读［J］.中国新药杂志，2015，24（4）：386-389，399.

［8］王宇光，马增春，梁乾德，等.中药毒性研究的思路与方法［J］.中草药，2012，43 （10）：1875-1879.

［9］SHAW D， GRAEME L， PIERRE D， et al. Pharmacovigilance of herbal medicine［J］. Journal of ethnopharmacology， 2012， 140（3）： 513-518.

［10］国家食品药品监督管理局．中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则［S］.北京：中国医药科技出版社，2005.