苦豆子凝胶薄层色谱鉴别研究

郭鸿雁 李军

基金项目：

2020年宁夏回族自治区重点研发项目（No.2020BFG03002）。

作者简介：

郭鸿雁（1967—），女，汉族，本科，正高职高级工程师，研究方向为中药开发方面的研究。E-mail：1197689256@qq.com

通信作者：

李军（1982—），男，汉族，博士在读，副教授，研究方向为中药资源及开发方面的研究。E-mail： lijunamy@126.com

【摘  要】

目的：建立苦豆子凝胶薄层色谱鉴别方法。方法：以槐定碱和苦参碱为对照品，以碘化铋钾试液为显色剂，优化不同供试品制备方法、展开剂、点样量等薄层色谱条件，考察不同薄层板、温度和湿度对苦豆子凝胶薄层色谱的影响，确定苦豆子凝胶剂的薄层色谱条件。结果：采用薄层色谱硅胶G板，甲醇溶解制备供试品溶液，点样量2～3 μL，二氯甲烷-甲醇-氨水（50∶6∶1）为展开剂，薄层色谱图显示斑点清晰，分离度较好。结论：该方法操作简便可行、专属性强、重现性好，结果准确、安全可靠，可作为苦豆子凝胶的薄层鉴别方法，制定其质量标准。

【关键词】

苦豆子；凝胶；槐定碱；苦参碱；薄层色谱

【中图分类号】R284.1    【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2023）22-0042-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.22.zgmzmjyyzz202322011

Study on the Identification of Sophora alopecuroides gel by Thin-layer Chromatography

GUO Hongyan  LI Jun*

College of Ningxia Vocational and Technical， Ningxia Research Center for the Development and

Utilization of Chinese Herbal， Yinchuan 750021， China

Abstract：

Objective To establish the thin-layer chromatography（TLC）identification method of Sophora alopecuroides gel. Methods Sophoridine and matrine were used as reference substances and bismuth potassium iodide test solution was used as color spreading agent to optimize the best TLC conditions of Sophora alopecuroides gel， and several factors were investigated， including different sample preparation methods， spreading solvents and sample amounts. Different manufacturers thin layer plates， different temperatures and different humidity were investigated to influence of Sophora alopecuroides gel by Thin-layer chromatography. Results The test solution of Sophora alopecuroides gel was extracted by methanol， the sample size was 2-3 μL. The spreading solvent was dichloromethane-methanol-ammonia （50∶6∶1）. The chromatographic spots were clear， without interference and easy to recognize. Conclusion The method is simple， feasible， specific， reproducible， safe and reliable. It can be used as a TLC identification method to formulate the qualitative standard of Sophora alopecuroides gel.

Keywords：

Sophora alopecuroides; Gel; Sophoridine; Matrine; Thin-layer Chromatography

苦豆子（Sophora alopecuroides L.） 是豆科槐属多年生半灌木植物，别名苦豆草、苦豆根、苦甘草，主产于宁夏、内蒙古、新疆、山西、陕西和甘肃等干旱荒漠地区［1-2］。主要成分为有生物碱、黄酮、挥发油和氨基酸等，生物碱包括槐定碱、苦参碱、槐果碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱、苦豆碱和金雀花碱等［3］，其中槐定碱和苦参碱含量最高。由于其较高的药用价值和生态功能，具有广阔的应用前景。有研究［4-7］表明，苦豆子具有清热解毒、抗菌消炎、止痛杀虫、燥湿止痢等作用。目前国内以苦豆子为原料开发的制剂主要有克泻灵片、妇炎栓、苦参素注射液、苦参素胶囊、复方苦豆子口腔溃疡复合膜等［8］，使其广泛应用于临床。本研究团队基于苦豆子总碱具有较强的抑制痤疮丙酸杆菌作用及抗炎活性，以期开发一种用于治疗防治痤疮、粉刺、脓疱等病症的苦豆子凝胶，該制剂质地细腻，附着性强，刺激性小，有良好的应用价值。

为完善该制剂质量标准中鉴别项的内容，参考2020年《中国药典》中药及制剂鉴别的薄层色谱法［9］与相关文献［10-13］，本研究优化了供试品制备方法、展开剂、点样量等色谱条件，完成了专属性和不同温湿度、不同薄层板的耐用性等方法学验证，建立了苦豆子凝胶剂的薄层色谱鉴别法，为制定该凝胶剂的质量标准提供依据。

1  仪器与材料

1.1  仪器  XP205电子分析天平（梅特勒-托利多公司）；DHG-9070A恒温干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；明澈-D 24超纯水系统（美国默克密理博有限公司）；200 mm×200 mm薄层色谱双槽展开缸（上海信仪仪器厂）。

1.2  材料  硅胶G薄层板（青岛海洋化工有限司，批号：20210418）、高效硅胶HSG板（烟台江友硅胶开发有限公司，批号：20211013）、硅胶G薄层板（青岛海胜精细硅胶化工有限公司，批号：20210814），二氯甲烷、甲醇、氨水、乙酸乙酯、冰醋酸、碘化钾、碱式硝酸铋钾等试剂均为分析纯，纯化水为自制。槐定碱（中国食品药品检定研究院，批号110784-201706）和苦参碱（中国食品药品检定研究院，批号110805-202010）。槐定碱1.111mg/mL、苦参碱1.540mg/mL。中试三批苦豆子凝胶（批号2022092701、2022112501、2022112502）为委托银川凤仪堂生物工程有限公司制备，不加苦豆子总碱的空白凝胶阴性对照为宁夏中药材开发与利用工程技术研究中心自制。

2  方法与结果

2.1  溶液配制

2.1.1  制剂及原料供试品的制备  分别取三批苦豆子凝胶三支，分别称取0.2 g加甲醇25mL溶解过滤，收集滤液，备用；称取0.1 g苦豆子总碱加甲醇50mL溶解过滤，收集滤液，备用。

2.1.2  对照品溶液制备  分别精密称取槐定碱和苦参碱对照品加甲醇定容至10mL，制备1.111mg/mL的槐定碱和1.540mg/mL苦参碱。

2.1.3  阴性对照溶液制备  取自制的不含苦豆子总碱空白凝胶剂，按2.1.1项下制制备阴性对照溶液。

2.1.4  碘化铋钾试液制备  取碱式硝酸铋钾0.85g，加冰醋酸10mL与水40mL溶解后，加4%碘化钾溶液5mL，加冰醋酸20mL，用水稀释至100mL，摇匀，备用。

2.2  试验方法  参照薄层色谱法（通则0502）试验［9］，吸取供试品溶液2～3 μL、对照品溶液2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷∶甲醇∶氨水（50∶6∶1）为展开剂，饱和30 min，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾试液，日光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。

2.3  薄层色谱条件的优化

2.3.1  展开剂的选择  吸取苦豆子凝胶和苦豆子总碱供试品、槐定碱和苦参碱对照品溶液各2 μL分别点于3个同一硅胶G薄层板上，分别以A［二氯甲烷∶甲醇∶氨水（50∶6∶1）］，B［乙酸乙酯∶乙醇∶氨水（50∶1∶0.5）］，C［三氯甲烷∶甲醇∶石油醚∶氨水（50∶5∶1∶1）］为展开剂，按2.2项下方法考察其对薄层色谱的影响。结果显示，A与C作为展开剂，凝胶和苦豆子总碱供试品与对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点，且斑点清晰，分离度好，效果最佳。B展开效果欠佳。由于三氯甲烷的毒性较大，考虑安全环保。故选用A［二氯甲烷∶甲醇∶氨水（50∶6∶1）］作为展开剂。结果如图1。

2.3.2  供试品制备方法的考察  分别按照以下4种方法制备供试品溶液，按2.2项下方法考察其对薄层色谱的影响。①称取苦豆子凝胶0.2 g，加入纯化水超声溶解，定容至25mL，滤过，得供试品溶液1。②称取苦豆子凝胶0.2 g，5滴10%CaCl2，摇匀后加入纯化水超声溶解，定容至25mL，滤过，得供试品溶液2。③称取苦豆子凝胶0.2 g，加入甲醇超声溶解，定容至25mL，滤过，得供试品溶液3。④称取苦豆子凝胶0.2 g，加入5滴10%CaCl2，摇匀后加入甲醇超声溶解，定容至25mL，滤过，得供试品溶液4。结果表明∶ 4种方法制备的供试品溶液主斑点与对照品溶液斑点的颜色、位置相同，均有较好的分离度。故供试品溶液制备方法选择简单、易操作的第3种。如图2所示。

2.3.3  不同点样量的选择  选用硅胶G薄层板，取样品溶液1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、6 μL分别点样，按2.2项下方法考察其对薄层色谱的影响。结果显示：对照品溶液和供试品溶液点样量在1～6 μL范围内，均能分离，各斑点清晰，其中1～3 μL分离度较好，考虑不同制剂含量差异，故选择点样量为2～3 μL。结果如图3所示。

2.4  苦豆子凝胶薄层色谱鉴别的方法學验证

2.4.1  专属性考察  分别吸取2批次的苦豆子凝胶供试品溶液、苦豆子总碱溶液、阴性对照溶液、混合对照品溶液各3 μL分别点与同一硅胶G薄层板上，按2.2项下方法考察其对薄层色谱的影响。供试品、苦豆子总碱与对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点，且斑点清晰，分离度好。而阴性样品溶液无干扰。说明该薄层色谱鉴别方法专属性强。结果如图4所示。

2.4.2  薄层色谱方法耐用性考察

2.4.2.1  不同厂家硅胶G薄层板的考察  分别在3个不同生产厂家硅胶G薄层板（青岛海洋化工有限公司、烟台江友硅胶开发有限公司、青岛胜海精细硅胶化工有限公司）点样3个批次供试品及槐定碱和苦参碱对照品，按2.2项下方法考察其对薄层色谱的影响。结果在3个不同品牌的硅胶G薄层预制板上，样品色谱中在与槐定碱、苦参碱对照品色谱相应位置上，显相同斑点，且斑点清晰，分离度良好。表明不同厂家生产硅胶G薄层板对薄层色谱鉴别方法无明显影响。结果如图5所示。

2.4.2.2  不同温度的考察  在同一厂家薄层硅胶G板上点样3个批次供试品及槐定碱和苦参碱对照品，在10 ℃、20 ℃、35 ℃3个不同温度下，按2.2项下方法考察其对薄层色谱的影响。结果展开样品色谱中在与槐定碱、苦参碱对照品色谱相应位置上显相同颜色斑点，且斑点清晰，分离度好。表明不同温度的对薄层鉴别无影响。结果如图6所示。

2.4.2.3  不同湿度的考察  在同一厂家薄层硅胶G板上点样3个批次供试品及槐定碱和苦参碱对照品，在32%、58%、88% 3个不同湿度下，按2.2项下方法考察其对薄层色谱的影响。结果展开样品色谱中在与槐定碱、苦参碱对照品色谱相应位置上显相同颜色斑点。表明不同湿度对薄层色谱鉴别方法基本无影响。结果如图7所示。

3  讨论

本研究建立苦豆子凝胶薄层鉴别方法，确定以槐定碱和苦参碱为对照品，以甲醇为溶剂制备供试品溶液，点样量2～3 μL，以二氯甲烷∶甲醇∶氨水=50∶6∶1为展开剂，饱和30 min，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾试液，日光下检视。

苦豆子凝胶剂作为新开发的用于防治痤疮的制剂，其主要有效成分为槐定碱和苦参碱，且两者的含量最高，故薄层色谱鉴别选择槐定碱和苦参碱为对照品［14］。薄层色谱鉴别是中药制剂鉴别的主要方法之一，因其设备简单、操作方便而被广泛应用［15］，但易受供试品制备方法、点样量，展开剂等相关条件影响［16-17］。因此，本研究优化了上述条件，确定了供试品制备用甲醇溶解，点样量为2～3 μL。由于三氯甲烷毒性较大，考虑实验人员的安全性和环保问题［18-19］，改用二氯甲烷，并进行了展开剂比例的优化调整，最终以二氯甲烷：甲醇：氨水（50∶6∶1）为展开剂，薄层色谱分离效果最好，且低毒安全，这也符合目前质量标准制定的基本要求［20］。作者在实验过程中发现，点样后薄层板再展开之前必须进行充分饱和，至少30 min，防止薄层色谱图产生边缘效应。可能的原因是充分饱和后，使展开缸中的展开剂气、液、固三相比例适当，斑点分离度较好［21］。

为了考察方法的专属性和耐用性，分别考察了阴性对照溶液、不同温度、不同湿度、不同厂家生产的硅胶G板等对所建立的苦豆子凝胶薄层色谱鉴别方法的影响。结果显示，阴性对照、不同温湿度和不同厂家薄层板的3批苦豆子凝胶供试品的色谱图均与对照品色谱图相应位置上显相同的颜色斑点，且斑点清晰，分离度好，效果佳，阴性无干扰。

本研究建立的苦豆子凝胶薄层色谱鉴别法操作简便可行、专属性强、重现性好，结果准确可靠，所用试剂安全环保，是控制苦豆子凝胶制备工艺、产品质量的快速检测方法，为制定苦豆子凝胶剂的质量标准提供了重要依据。

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（收稿日期：2023-02-23  编辑：刘  斌）