山东荣成海带病害原因的初步调查及分析

刘晓慧，盖珊珊，辛美丽，詹冬梅，范妮妮，刘玮

（1.山东省海洋科学研究院，山东省大型海藻资源保护与应用工程技术研究中心，山东 青岛 266104；2.青岛市大型海藻工程技术研究中心，山东 青岛 266104；3.中国水产科学研究院长岛增殖实验站，山东 长岛 265800）

海带（Saccharina japonica）是我国最重要的养殖经济藻类，养殖产量占我国藻类养殖总产量的50%以上[1]，具有良好的食用、药用和工业价值[2,3]。养殖面积不断扩大和养殖密度居高不下加剧了海带养殖病害的爆发，影响了海带养殖产业的发展[4-7]。荣成是我国北方重要的海带养殖基地，产量达全国海带养殖产量的30%[8]，2021 年底，荣成北部海域突发海带规模性病害，截至2022 年1 月已殃及荣成北部全部海带养殖产区，并逐渐向南蔓延。

根据致病原因，海带病害主要包括生理性病害和病原性病害两大类，前者如绿烂病、白烂病和泡烂病等，由环境因素变化引发；后者如畸形病、叶卷病等，由微生物病原体引发[6,7]。近年来报道的海带病害多为生理性病害，如2018 年10 月山东威海育苗场的绿烂病；2019 年3 月福建莆田的烂孔病和2019 年7 月山东青岛的黑斑病等[9,10]，而有关海带病害的研究主要集中在病原分析、生化组分变化、褐藻多酚抑菌效果及附生菌群落结构等[7,10-15]。虽然目前海带病害已得到了越来越多的关注，但由于海带病害种类多、病因错综复杂、病程各具特殊性等原因，导致可供分析的病害病例资料仍相对匮乏。

形态学是分类研究最直观的依据，形态性状差异分析不仅广泛应用于藻类群体分化、品系筛选等研究[16-18]，也是分析病害发生的重要手段。本研究采用方差分析、判别分析及相关性分析等比较研究了荣成湾至爱莲湾海域的成山、俚岛、瓦屋石和寻山4个海区海带的形态特征、组织成分含量及海区营养盐含量，以期阐明病害对荣成养殖海带的影响，探寻病害的病程特点和致病原因，为海带病害的诊断与防治提供帮助。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2022 年1 月6 日，在荣成沿岸4 个养殖海区采集海带样品（图1）。采样时4 个养殖海区的海带均已发病，成山和俚岛海带为点状白烂，瓦屋石和寻山海带为绿烂，其中成山海带病烂最为严重，俚岛次之，瓦屋石和寻山病情较轻，且寻山海带处于幼苗暂养期。各海区随机采集海带不少于30 棵，共计131 棵（表1）。海带样品现场采集后0 ℃保存并立即转运至实验室进行后续处理，海水水样以0.45 μm 滤膜现场抽滤后冷冻保存备用。

图1 荣成海带采样地点Fig.1 Sampling sites of kelp S.japonica in Rongcheng

1.2 海带形态特征测量

海带藻体冲洗后擦干表面测量体长、体宽和鲜重，计算体长/鲜重、体宽/鲜重和体长/体宽的比值。用色差仪（威福光电WR-10）测定海带叶片生长部L*、a*、b*色度值，即明度、红绿色度和黄蓝色度[19]。

1.3 海带组织成分测定

测定了海带样本组织的含水率、可溶性糖、可溶性蛋白、叶绿素a 和类胡萝卜素含量，每个成分重复测定3 次。海带样品于80 ℃下烘干至恒重测定含水率；可溶性糖参照农业行业标准（NY/T 1278-2007）测定；可溶性蛋白参照考马斯亮蓝法测定；叶绿素a 和类胡萝卜素参考史修周等[20]的方法测定。按下列公式计算叶绿素a 和类胡萝卜素的含量，总色素为叶绿素a 和类胡萝卜素含量之和。叶绿素a 含量=12.72A663-2.59A645，类胡萝卜素含量=[1000×A470-3.27×（12.72A663-2.59A645）-104×（22.88A645-4.67A663）]/229。

1.4 海区营养盐浓度测定

海水样品中无机氮和活性磷酸盐浓度参照《海洋调查规范第4 部分：海水分析》（BG/T 17378.4-2007）分析测定，每个样品重复3 次。

1.5 数据分析

用Excel 软件处理数据。用SPSS19.0 软件对海带形态特征进行方差分析和判别分析；对海带组织成分含量和海区营养盐浓度进行方差分析；对海带形态特征、组织成分含量及海区营养盐浓度进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 海带病害症状

与同期正常养殖海带（图2-a）相比，发病海带叶片颜色变浅，发黄发白，溃烂脱落，病情严重的仅剩假根附近藻体（图2-b）。调查中发现了点状白烂和绿烂等多种病害症状，其中成山和俚岛海带主要为点状白烂病，叶片脆硬，出现不规则白点并逐渐变薄形成孔洞，孔洞向中部和生长部蔓延扩大，最终导致叶片大面积溃烂和脱落（图2-c、d）；瓦屋石和寻山海带则表现出绿烂病的症状，叶稍和叶缘发黄发绿，伴随变软发粘而腐烂，绿烂部位逐渐向中下部扩大（图2-e、f）。

图2 海带病害特征Fig.2 Clinic symptoms of the diseased kelp S.japonica

2.2 海带形态差异

2.2.1 生长指标

所有海带样品的平均体长、体宽和鲜重分别为（617.1±310.5）mm、（124.6±70.5）mm 和（46.5±44.5）g。成山海带在所有群体中叶片溃烂最为严重，生长指标最低，平均体长、体宽和鲜重分别为（270.3±110.0）mm、（69.3±31.8）mm 和（10.8±8.7）g。寻山海带处于幼苗暂养期，但生长指标高于成山海带，平均体长、体宽和鲜重分别为（556.9±88.0）mm，（70.3±20.7）mm，（19.1±8.9）g。俚岛海带平均体长、体宽和鲜重分别为（728.7±92.1）mm、（167.4±30.7）mm 和（63.3±19.7）g，均显著高于成山和寻山海带。瓦屋石海带生长指标最高，平均体长、体宽和鲜重分别为（1 039.5±177.1）mm、（211.9±50.5）mm 和（105.8±43.5）g（表1、图3）。

图3 海带体长、体宽和鲜重箱线图Fig.3 Boxplot of body length,body width and fresh body weight of kelp S.japonica samples

结果发现，不同海带群体间生长指标的差异显著，但体长、体宽和鲜重均表现出相同的变化规律，由低到高依次为成山、寻山、俚岛和瓦屋石，其中寻山和成山海带的生长指标低于整体平均水平，瓦屋石和俚岛海带高于整体平均水平（图3）。

2.2.2 颜色指标

成山和俚岛海带L*、a*、b*的平均值分别为31.70±4.77、7.10±0.71、20.50±5.60 和34.10±1.52、8.60±0.60、23.1±2.95，两个群体L*和b*值差异不显著，且均高于瓦屋石海带，低于寻山海带，表明成山和俚岛海带颜色的明度和黄蓝色度较为接近，与瓦屋石海带相比颜色较浅且偏黄；与寻山海带相比颜色较深且偏蓝（黄蓝色度上b*值较高）。瓦屋石海带L*、a*、b*的平均值分别26.10±2.30、6.80±0.79 和13.50±3.72，3 个色度值均低于其他群体。寻山海带L*、a*、b*的平均值分别为39.90±3.76、7.40±0.66 和26.00±2.54，其中L*和b*值高于其他群体（图4）。

图4 海带L*、a*、b*色度值箱线图Fig.4 Boxplot of L*,a*and b*of kelp S.japonica samples

2.2.3 判别分析

采用逐步判别法从体长、体宽、鲜重、体长/鲜重、体宽/鲜重、体长/体宽和L*、a*、b*共9 个特征值中筛选出6 个，建立了4 个海带群体的判别公式：

成山Y=0.081X1+0.421X2+0.393X3+45.045X4+117.228X5-36.289X6-779.090；

俚岛Y=0.113X1+0.334X2+0.253X3+49.819X4+137.095X5-40.578X6-1011.333；

瓦屋石Y=0.124X1+0.436X2-0.284X3+44.941X4+123.410X5-37.774X6-819.476；

寻山Y=0.093X1+0.303X2+3.204X3+52.969X4+127.778X5-41.174X6-1044.423。

式中，X1～X6分别代表体长、体长/鲜重、体长/体宽、L*、a*、b*。依据判别方程式进行判别分组，4 个群体的判别准确率在90.0%～100.0%之间，其中俚岛群体判别准确率最高为100.0%，综合判别率为94.6%（表2）。

表2 4 个海带群体的判别分析Tab.2 Discriminant results of 4 populations of kelp S.japonica

2.3 海带组织成分

各群体海带含水率变化范围为85.4%～93.2%，寻山最高，成山最低。海带叶绿素a、类胡萝卜素和总色素含量变化范围分别为0.21～0.46 mg·g-1、0.03～0.08 mg·g-1和0.24～0.54 mg·g-1，均是寻山最高，俚岛最低，成山和瓦屋石介于二者之间。海带可溶性糖含量变化范围为0.02%～0.07%，成山最高，其他3 个群体差异不显著。海带可溶性蛋白含量变化范围为0.32～0.85 mg·g-1，由高到低依次为瓦屋石、寻山、俚岛和成山（图5）。

图5 不同海带群体的组织成分含量Fig.5 Biochemical component contents of different populations of kelp S.japonica

2.4 海区营养盐

各采样海区无机氮和活性磷酸盐浓度的变化范围分别为0.024～0.094 mg·L-1和0.001～0.007 mg·L-1，其中成山海区无机氮浓度最高，其他3 个海区无机氮浓度均低于0.038 mg·L-1；俚岛和瓦屋石海区活性磷酸盐浓度相对较高，成山和寻山活性磷酸盐浓度较低（图6）。成山、俚岛、瓦屋石和寻山海区氮磷比分别为94∶1、3.4∶1、6.3∶1 和27∶1。调查海区整体无机氮浓度为（0.045±0.028）mg·L-1，活性磷酸盐浓度为（0.003±0.002）mg·L-1。

图6 不同海区的营养盐浓度Fig.6 Nutrient concentrations in different mariculture areas

2.5 相关性分析

2.5.1 海带体长、体宽、鲜重与生长指标、颜色指标和组织成分含量的相关性分析

对点状白烂群体（成山、俚岛）和绿烂群体（瓦屋石、寻山）海带的体长、体宽、鲜重与生长指标、颜色指标和组织成分含量的相关性分析表明，点状白烂群体的体长、体宽、鲜重与色度值a*呈显著正相关，绿烂群体的体长、体宽、鲜重与L*、a*、b*色度值呈显著负相关。两种病害群体各自的体长、体宽和鲜重之间均存在显著的正相关关系，但体长、体宽和鲜重与组织成分含量之间的相关性不显著（表3）。

表3 海带体长、体宽、鲜重与生长指标、颜色指标和组织成分含量之间的相关性Tab.3 Correlation between body length,body width,fresh body weight and growth indicator,color indicator,biochemical component contents of kelp S.japonica

2.5.2 海区营养盐浓度与海带生长指标、颜色指标及组织成分含量的相关性分析

不同病害海区营养盐浓度与海带生长指标、颜色指标及组织成分含量的相关性分析表明，成山和俚岛海区无机氮和活性磷酸盐浓度与海带生长指标、颜色指标及组织成分含量之间的相关性均不显著；瓦屋石和寻山海区无机氮浓度与海带体长呈显著正相关，与色度值L*呈显著负相关，活性磷酸盐浓度与海带鲜重呈显著正相关；各海区无机氮和活性磷酸盐浓度与海带组织成分含量之间的相关性均不显著，但除含水率外，无机氮浓度和其他组织成分含量的相关系数均为正值，呈正相关（表4）。

表4 海区营养盐浓度与海带生长指标、颜色指标和组织成分含量之间的相关性Tab.4 Correlation between mariculture area nutrients and growth indicator,color indicator,biochemical component contents of kelp S.japonica

3 讨论

3.1 海带病害特征

自海带筏式养殖技术建立以来，海带病害时有发生[9,10,21]，是制约海带养殖产业发展的重要瓶颈。2021 年底山东荣成沿岸海区发生的海带病害范围之广，损失之重近五十年来少见。截至采样时，荣成北部海带养殖区均受到此次病害的严重影响，面临减产甚至绝产的风险。与以往单一病害的报道不同，此次海带发病存在点状白烂和绿烂等多种病害症状，其中成山和俚岛海带主要为点状白烂病，而瓦屋石和寻山海带主要为绿烂病（表5）。

点状白烂病和绿烂病都是海带人工养殖中常见的病害。其中点状白烂病属于栽培期生理性病害，发病速度快，3～5 天就会造成严重的病烂[22]。成山和俚岛海带叶片上先出现不规则白点，随后白点逐渐腐烂形成孔洞，孔洞连成片导致叶片整个白烂脱落，孔洞和脱落边缘发白发黄，叶片脆硬，与1963—1964 年间烟台和威海海带点状白烂的记录特征一致[21]。绿烂病在海带育苗期和栽培期均有可能发生，环境条件的不适和褐藻酸降解菌的大量繁殖分别会造成海带生理性绿烂和病原性绿烂[6,10]。褐藻酸降解菌通常在海带遭受环境胁迫、抗病力下降时大量繁殖，使病情扩大，但环境因子往往是诱发海带大规模绿烂的主要原因[10,23,24]（表5）。近年来海带绿烂病多发生在育苗期[10,25]，栽培期绿烂病的报道相对较少，而此次调查中瓦屋石和寻山海带均有绿烂迹象，但症状相对较轻，仅叶稍和叶缘出现了黄绿和软烂，叶片形态较为完整。海带病害的诱因错综复杂，同一表征也可能由不同的原因引起，如海区营养盐过高或受光不足时，海带容易发生绿烂，水质贫瘠或光照过强时，则常常发生各种白烂[10,21]。也有研究表明，营养盐浓度过高或过低都可能发生绿烂病[25]。荣成此次病害范围广、种类多，调查海区养殖海带的发病率高达100%，是环境条件引发的生理性病害，可能与海区营养盐和光照等多个环境条件的不同变化有关。

3.2 海带形态差异

此次病害由荣成湾向南蔓延，先北后南逐渐发病。位于采样海区最北端的成山海带受病害影响的时间最早，采样时海带叶片溃烂严重，大部分海带仅剩假根附近藻体，生长指标甚至低于幼苗暂养期的寻山海带。由成山向南至俚岛和瓦屋石，海带体长、体宽和鲜重的生长指标逐渐变好，且群体间差异显著，判别准确率在90.0%～100.0%之间。在以往报道中，荣成桑沟湾正常养殖海带1 月的平均体长、体宽和鲜重可分别达到（1 860±490）mm、（310±60）mm 和（282±167）g[26]（表5），此次调查中4 个海带群体的平均体长、体宽和鲜重均低于同期桑沟湾养殖海带的生长水平，其中病情最为严重的成山海带鲜重为桑沟湾海带鲜重的3.8%，病情较轻的瓦屋石海带鲜重也仅为桑沟湾海带鲜重的37.5%，可见此次病害对荣成养殖海带生长造成了严重的影响。

海带颜色变化普遍存在于生长不良及养殖病害发生的过程中，如缺氮导致的藻体淡黄[27]，白烂病的叶色淡褐和白化，绿烂病的绿色腐烂，黑斑病的黑色斑点，白斑病的白色斑块等，其颜色变化都是相应病害中典型的病理表征[5,7,28]。成山和俚岛海带表现为点状白烂，其L*和b*值均显著高于瓦屋石海带，反应出成山和俚岛海带叶片颜色较浅且偏黄，这与点状白烂海带叶片发白的颜色症状相吻合[22]。在相关性分析中，成山和俚岛海带的生长指标与L*和b*色度值的相关性虽不显著，但均为正值，表明在生长过程中点状白烂病使海带叶片颜色变浅发黄的趋势。瓦屋石海带为绿烂，其a*值在4个群体中最低，反应出瓦屋石海带颜色相对偏绿，这与观察者对海带绿烂病叶片颜色明显发绿的感官认知也相一致[5]，相关性分析中，瓦屋石和寻山群体的生长指标与a*值呈显著负相关，说明海带在生长过程中a*值降低，表明了绿烂病使叶片发绿的趋势。但除了病害作用，海带颜色也受到生长阶段等其他因素的影响，海带孢子体在生长发育过程中叶片颜色会随生长而慢慢加深，由幼龄期的淡褐色逐渐变为厚成期的浓褐色[27]。这解释了寻山海带L*和b*值高于成山、俚岛和瓦屋石海带的原因，反应了成山、俚岛和瓦屋石海带的生长。

3.3 海带组织成分

海带病害过程中生理生化反应的改变会造成色素、可溶性糖、可溶性蛋白等组织成分含量和抗氧化能力的变化[7,12]。叶绿素含量影响植物的光合速率和光合能力，反映了植物体的生产力水平[29]，类胡萝卜素是光合作用的辅助色素，二者对自由基的清除具有共同作用，有一定的抗氧化活性[30]。健康海带中色素含量通常随海带的生长而增加，与海带生长环境中光强、光周期及水温等因素的变化节律相协调[31]。在本研究中，病症较为严重的成山和俚岛海带色素含量，特别是叶绿素a 含量，均显著低于病症最轻且尚处于幼苗暂养期的寻山海带，相比之下叶绿素a 含量降低了41.3%～54.3%。瓦屋石和寻山海带色素含量虽然高于成山和俚岛海带，但也低于以往报道的新鲜海带叶绿素a 的含量0.877 mg·g-1[30]（表5）。在Wang 等[7]对海带白斑病的相关研究中，也发现了病害减缓海带体内色素积累的现象，并指出低色素含量在海带抵御病害中发挥重要作用。色素含量是海带病害发生过程中变化较为明显的组织成分之一。

光照影响海藻体内叶绿素a 和类胡萝卜素的含量，随光照强度的增加，两种色素的含量往往降低[32-34]，而色素含量的降低也会反过来有助于海带调节光合作用以适应环境压力[31]。栽培水层光照的突然增强又往往会引起点状白烂病的发生[10]。推测光照强度的增大可能是成山和俚岛海带发生点状白烂，并使其色素含量降低的重要原因。调查中了解到荣成近岸海带养殖区同期曾遭受赤潮影响，海水中藻细胞密度一度达到3×106个/L，赤潮过后海水水色由铁锈色变澄清，海水透明度升高，这也证实了强光照射造成海带发病的推测。

可溶性蛋白和可溶性糖是衡量植物代谢水平的成分指标，同时作为抵御逆境胁迫的重要组分，在面临高温、重金属胁迫及病烂发生时，海带及其他褐藻往往会因为体内产生抗体蛋白而使可溶性蛋白含量先有小幅上升，在防御遭到破坏后含量逐渐下降[12,35,36]。本研究中，瓦屋石和寻山海带的病害症状相对较轻，对应着较高的可溶性蛋白含量；病情较重的成山和俚岛海带与寻山相比，可溶性蛋白含量降低了26.4%～56.0%，也恰好可以反应出病害对海带产生影响的作用过程。不同病害群体的可溶性糖含量均低于桑沟湾养殖海带的可溶性糖含量水平[37]（表5），表明了病害影响下海带可溶性糖含量下降的趋势[12]。

3.4 养殖海区营养盐

氮、磷是海带生长必需的营养元素，在自然海水中浓度不高，又时常由于浮游藻类的生长繁殖而消耗[38]，常成为海藻生长的限制性营养盐[39]。海带养殖中，氮、磷浓度分别在0.1 mg·L-1和0.004 mg·L-1以上更为适宜，氮浓度在0.05 mg·L-1以下时，会影响海带生长[27]。历史资料表明，荣成近岸海区的营养盐水平较低，夏季浮游植物的生长常受到磷的限制，且营养盐波动与海带的生长周期有一定的关系。在11 月海带生长初期营养盐浓度较高，5 月海带生长后期营养盐浓度较低[40,41]。本调查研究在1月开展，处于海带生长前期，但无机氮和活性磷酸盐的整体浓度分别为（0.045±0.028）mg·L-1和（0.003±0.002）mg·L-1，与荣成爱莲湾3、4 月份的水平类似。爱莲湾海带养殖海区低区3、4 月的氮、磷浓度分别为0.04 mg·L-1和0.002 mg·L-1，已达到限制营养水平[42]，说明本次调查中荣成近岸养殖海区的营养盐提前进入了贫瘠状态。而且成山和寻山海区的氮磷比高达94∶1 和27∶1，均高于Redfield比值16∶1[43]，存在不同程度的磷限制，而俚岛和瓦屋石海区氮磷比分别为3.4∶1 和6.3∶1，存在不同程度的氮限制。相关分析中海区无机氮浓度与海带色素、可溶性糖、可溶性蛋白等组织成分的含量存在一定的正相关关系。也有研究表明，氮加富会促进氮在色素中的分配，使叶绿素a 和类胡萝卜素含量增加[39]，因此氮、磷限制会影响海带组织成分的积累，影响海带的正常生长。赤潮时浮游藻类的生长繁殖会消耗大量的营养盐，因此极有可能是赤潮导致了荣成近岸养殖海区营养盐浓度的异常偏低，加剧了氮磷的限制和光照强度的变化，引发了海带病害。