一株野生盖囊侧耳的鉴定与驯化栽培

肖自添，何焕清，彭洋洋，刘明，徐江

（1.广东省农业科学院蔬菜研究所，广东 广州 510640；2.广东省草菇科技创新中心/广东省蔬菜新技术研究重点实验室，广东 广州 510640）

盖囊侧耳（Pleurotus cystidiosus）又称鲍鱼菇、高温平菇、黑鲍菇等，是侧耳科侧耳属真菌，是一种高温季节发生的珍稀菌类，在我国多分布于台湾、福建、广东、浙江、云南、海南和广西等南方热带地区，在北美洲、欧洲也有分布[1]。野生盖囊侧耳多发生于榕树、刺桐、凤凰木、番石榴及法国梧桐等的腐木上。盖囊侧耳肉质肥厚，味道鲜美，风味独特（有鲍鱼风味），经煮耐贮，适合鲜销和罐制[2]，且具有多种生物活性作用，如抗氧化[3]、抗肿瘤[4]和降血糖[5,6]等，是一种具有食用和药用双重价值的珍稀菌类。盖囊侧耳自然条件下发生较少，关于盖囊侧耳的鉴定、驯化栽培报道也较少。黄年来等[7]、李翠新等[8]和李蝶等[9]在福建、昆明及广西等地发现了野生盖囊侧耳，并开展了鉴定和部分驯化栽培试验。我国从20 世纪70 年代初开始驯化、引种栽培盖囊侧耳，由于高温高湿的气候条件，鲍鱼菇被大力推广种植，研发了多种菜谱，生产的罐头畅销到东南亚及港澳台等地，深受消费者喜爱[10]。福建三明真菌研究所黄年来等在70 年代采集到野生盖囊侧耳进行驯化栽培，获得成功[11,12]。随后郭美英[13]、赵彦杰[14]和胡晓艳等[15]对盖囊侧耳（鲍鱼菇）的生物学特性、栽培技术和优良配方筛选等进行研究并推广，使得盖囊侧耳在国内逐渐被消费者所认识，但由于其发菌速度相对同属侧耳属的平菇、凤尾菇和秀珍菇等慢，生物转化率相对偏低，市场上鲍鱼菇的产品依然比较少见。盖囊侧耳适合在炎热的夏季栽培，自然条件下其他食用菌难以生长，鲜菇断档的时候可作为有益的补充，满足消费者需求。目前，我国栽培的食用菌品种大多是中低温型品种，集中在秋、冬、春三季，工厂化周年生产的也是中低温的金针菇、杏鲍菇[16]、海鲜菇及双孢菇等能耗大、生产成本高的品种。寻找耐高温的优良食用菌种质资源，选育耐高温菌株并进行推广利用对我国食用菌产业健康发展十分有意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 供试野生菌株采集于华南师范大学广州天河石牌校区一棵紫荆花树上，经广东省农业科学院蔬菜研究所进行分离、提纯和保存，编号为HSBYG，子实体形态见图1。

图1 鲍鱼菇HSBYG 菌株子实体生态照Fig.1 Fruiting bod ? HSBYG strain

1.1.2 供试试剂 PCR 引物为ITS1 与ITS4，PCR 聚合酶（B639297-0005），由上海生工生物工程有限公司制备。DNA 提取与检测试剂盒（B518259-0100），购自上海生工生物工程有限公司。PDA培养基购自江门市雅康农业科技有限公司。

1.1.3 生物学特性培养基 碳源试验培养基：蛋白胨0.2%、琼脂2%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.15%、2%碳源、蒸馏水1 000 mL。替代碳源采用葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、淀粉和麦芽糖。

氮源试验培养基：葡萄糖2%、琼脂2%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.15%、0.2%氮源、水1 000 mL。替代氮源采用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、黄豆粉和麸皮等有机氮以及氯化铵、硫酸铵。

温度试验培养基：PDA 培养基。

pH 试验培养基：PDA 培养基，并用1 mol/L 盐酸和1 mol/L 氢氧化钠调节培养基pH。

1.1.4 驯化栽培培养基 原种及栽培种配方：棉籽壳88%、麸皮10%、碳酸钙1%、石灰1%，含水量约60%、pH 为8。

栽培出菇配方：棉籽壳50%、玉米芯34%、麸皮15%、石灰1%，含水量约62%。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离与培养 采用组织分离法。在无菌条件下对野生株子实体进行表面消毒，用手术刀从菌柄与菌盖交汇处切出大约0.3 cm2大小的组织块，放于母种培养基中，置于（25±1）℃的恒温箱中避光培养。待菌丝体长满后，编号为HSBYG，再次转管，放于4～8℃冰箱中冷冻保藏。

1.2.2 菌株的形态鉴定 观察HSBYG 菌株的子实体形态，记录其表观特征。显微镜观察HSBYG 菌株的菌丝和孢子形态。

1.2.3 菌株的分子鉴定 采用试剂盒提取法提取总DNA，依照上海生工生物工程有限公司购回的真菌DNA 提取试剂盒的试验步骤得到DNA，保存于 20 ℃。

PCR 扩增反应在基因有限公司的Veriti 型PCR扩增仪上进行，ITS-PCR 反应体系（20L）为：基因组DNA 0.2L（模板），正反引物（56mol/L）各0.8L，两条引物分别为ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG），ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC），2 Flash PCR Master Mix（Dye）10L，补充ddH2O 至20L。

扩增反应程序：98 ℃预变性30 s，94 ℃变性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，循环33 次；完成后保存在4 ℃冰箱，由上海生工生物工程股份有限公司进行测序。

系统发育树构建，将菌株检测完成后送回的ITS基因组顺序，提交到GenBank 核酸扩增序列数据库中，进一步运用BLAST 程序，与GenBank 和CBOL中的ITS 基因组序列开展同源性比对，搜索相似的基因序列，用MEGA7.0 软件系统，Neighbor-Joining 法构建系统发育树，Kimura2-parameter法估算遗传间距，分析同源关系。

1.2.4 生物学特性研究 最适碳源、氮源、温度及pH试验均采用平板培养法（直径90 mm），进行5 次重复试验。无菌条件下，先将已活化的约0.4 cm2组织块，直接接种于培养器中，于接种块下方划一刻度线作为测量的开始线，置于28 ℃恒温箱中避光培养，待其中一试验组长满培养皿后，终止培养，计算菌丝日均长速。菌丝的生长速率=菌落半径增长度（mm）/培养时间（d）。温度试验置于不同温度的恒温培养箱内，避光培养。

1.2.5 驯化栽培试验 试验选用规格为17 cm 36 cm、厚0.5 mm 的聚丙烯塑料袋，每袋装培养料约500 g（干重计），含水量60%～62%，30 包，3 次重复。采用常规代料栽培方法。接种后将菌包搬入恒温培养室内发菌，室内保持黑暗，培养过程中发现受污染的菌包及时清理出培养室。待菌丝长满菌包后进行出菇管理。打开盖子取下套环，将菌袋均匀摆放到出菇房，保持温度25～28 ℃、空气相对湿度85%～95%，出菇房经常通风换气，保持新鲜的氧气供应。记录菌丝生长速度、产量和子实体商品性等。

1.2.6 子实体粗多糖、总三萜含量测定 子实体粗多糖检测采用《NYT 1676-2008 食用菌中粗多糖含量的测定》、总三萜参考《NYT 3676～2020 灵芝中总三萜含量的测定》。

1.3 数据统计分析

试验数据的处理和分析采用Excel 统计软件。

2 结果与分析

2.1 菌株子实体形态特征

供试菌株子实体为丛生，部分为单生，菌盖直径达7～14 cm，菌盖初期黑色，后为灰黑色或黑褐色，最后变为暗灰色，扇形至平展，表面光滑、干燥，菌肉较厚，淡黄色，菌褶间距稍宽，线状延生，不等长，乳白色；菌柄中生或偏生，长1.8～9.8 cm，粗1.1～3 cm，暗灰色。菌丝体白色，在PDA 培养基上呈放射性状生长（图2 a），气生菌丝比较旺盛，有锁状联合（图2 b），后期可形成大量黑色分生孢子梗束（图2 a），栽培菌包成熟后也会形成大量黑色分生孢子梗束，分生孢子呈长椭圆形或棒状（图2 c），孢子印乳白色（图2 d），孢子透明，结果与黄年来编著的《中国食药用菌学》中鲍鱼菇的特征较一致。

图2 鲍鱼菇HSBYG 菌丝体和孢子形态Fig.2 Mycelial and spore of Pleurotus cystidiosus HSBYG strain

2.2 分子生物学鉴定

经PCR 扩增和ITS 序列测定，得到HSBYG 菌株的ITS 片段序列长度为696bp，见图3 和图4。将检测结果在GeneBank 上加以比对，发现该菌株与侧耳属的盖囊侧耳（Pleurotus cystidiosus，登录号:KX787085.1）的物种相似性最大，达99.71%。进一步使用了MEGA7.0软件，以供试菌株和CBOL 和Gene Bank 中的已知侧耳属（Pleurotus）菌株ITS片段构建系统进化树（图5），供试菌种与盖囊侧耳（Pleurotus cystidiosus）的亲缘关系最近。结合形态学和ITS 序列测定，可以确定该野生菌株为侧耳科侧耳属盖囊侧耳，也称鲍鱼菇，编号为HSBYG。

图3 供试菌株HSBYG 测序结果Fig.3 The sequencing result of Pleurotus cystidiosus HSBYG strain

图4 供试菌株HSBYG 的ITS 序列扩增效果Fig.4 The ITS sequencing result ofHSBYG strain

图5 不同侧耳属DNA-ITS 序列间构建的系统发育树Fig.5 The phylogenetic trees of different Pleueras by the DNAITS sequences

2.3 不同碳源对HSBYG的菌丝体生长影响

从表1 得知，HSBYG 的菌丝在葡萄糖和蔗糖等6 种碳源中均可正常生长（图6），在以麦芽糖为碳源培养时，菌丝长势好，生长速度快，达到了3.30 mm/d，其次为淀粉和果糖，但三者没有显著差异；以乳糖为碳源时菌丝生长速度最慢，仅有1.94 mm/d，极显著低于其他碳源。综上所述，该菌株菌丝的最佳碳源是麦芽糖，其次是果糖和淀粉。

表1 不同碳源对HSBYG 菌丝生长情况比较Table 1 Effect of carbon sources on mycelia growth of HSBYG

图6 不同碳源对HSBYG 的菌丝体生长的影响Fig.6 Effect of carbon sources on mycelia growth of HSBYG

2.4 不同氮源对HSBYG的菌丝体生长影响

由表2 可知，HSBYG的菌丝在牛肉膏和蛋白胨等7种氮源中均可生长（图7）以牛肉膏为氮源时，HSBYG的菌丝长势最好，生长速度最快，达3.13 mm/d，其次是黄豆粉和麸皮，但三者没有显著差异；以硫酸铵为氮源时菌丝生长速度最慢，长势弱，仅有0.97 mm/d，其次是氯化铵，这两种氮源极显著低于其他氮源，且接种后发菌时间也比其他氮源慢。黄豆粉和麸皮的长速和长势居中，优于蛋白胨和酵母膏，但四者间没有显著差异。综上所述，该菌株菌丝的最佳氮源是牛肉膏，其次是黄豆粉和麸皮。

表2 不同的氮源对HSBYG 菌丝生长情况比较Table 2 Effect of nitrogen sources on mycelia growth of HSBYG

图7 不同氮源对HSBYG 菌丝体生长的影响Fig.7 Effect of nitrogen sources on mycelia growth of HSBYG

2.5 不同pH对HSBYG的菌丝体生长影响

由表3 可知，HSBYG 的菌丝在pH 5.0～9.0 的范围内均可正常生长（图8），说明其可生长的pH范围较广，随着pH 升高，菌丝生长速度呈上升趋势，pH 在7.0 时，菌丝生长速度和长势均为最优，长速达3.37mm/d，其后菌丝生长速度和长势趋于平稳，pH 8.0～9.0 的长速均比pH7.0 的要慢，但没有显著差异。pH 在5.0 的时候，发菌晚，生长速度慢，表明pH 低于6 不适合H SBYG菌丝生长。综上结果可知，HSBYG菌株比较适合在中性偏碱的环境中生长，适宜生长的pH 是7.0。

表3 不同PH 对HSBYG 菌丝生长情况比较Table 3 Effect of pH on mycelia growth of HSBYG

2.6 不同温度对HSBYG的菌丝体生长影响

不同温度HSBYG 菌丝生长的影响结果，见表4，HSBYG 菌丝在15～35 ℃的范围内均可生长（图9），10 ℃时菌丝不能萌发，但是随着温度的升高，菌丝生长速度呈先升后降的趋势，当培养温度达到25 ℃时，菌丝生长速度达到最快，随后会随着温度的升高而下降，培养温度高于30 ℃时菌丝生长速度会进一步放缓。综上结果可知，该菌株适宜在25～30 ℃范围生长。

表4 不同的温度对HSBYG 菌丝生长情况比较Table 4 Effect of temperature on mycelia growth of HSBYG

2.7 HSBYG的子实体商品性及多糖、三萜含量分析

HSBYG 液体菌种培养5 d 即可用于接种，接种约30 d 长满菌包，开袋后约7 d 出现原基（图10），现原基后7～8d 即可采收，见图11。生长周期为50～60 d，生长速度较平菇、秀珍菇慢。子实体出菇整齐，肉质厚实，子实体单丛鲜重为95～195 g，含水量为84%～90%，菌盖长4～12 cm、宽5～10 cm，瓦扇形，菌盖厚1～3 cm，一潮菇生物转化率约为27%，子实体多糖为5.97%，三萜含量为1.12%。

图11 可采收的HSBYG 子实体Fig.11 The harvestable fruiting body of HSBYG

3 讨论

盖囊侧耳为高温型菌株，黄年来等[11]对福建一株野生鲍鱼菇进行人工栽培，指出该菌株菌丝最适宜生长温度是27～28 ℃，子实体发生温度25～33 ℃，最适温度为27～28 ℃。李蝶等[9]对广西大学校园内一株野生泡囊侧耳进行驯化栽培，最适生长温度为25～30 ℃，其中以30 ℃为最佳，本试验株菌丝最适生长温度为25～ 30 ℃，其中以25 ℃最佳，子实体在25 ℃条件下开袋7 d 左右发生原基，15 d 左右采收，与黄年来等[17]和李蝶等[9]研究较一致。盖囊侧耳为木腐型真菌，对纤维素和木质素分解利用较强，李蝶等[9]以木屑为主料栽培其生物学效率可达到43.33%，单菇重为79.51g/朵。徐彦军等[17]利用玉米芯和玉米秆栽培鲍鱼菇，结果显示玉米芯营养更好，覆土栽培生物转化率可达61.78%。汪国莲等[18]利用意杨木屑添加适量棉籽壳进行脱袋覆土培养鲍鱼菇，其生物学转化率可达105%。本试验以棉籽壳和玉米芯为主料栽培，单丛重为95～195 g，子实体商品性较好，出菇整齐。本试验只采收一茬，生物转化率为27%，生物学效率略低，但从子实体商品性和第一茬产量比较，试验结果与李蝶、徐彦军的结果较一致。鲍鱼菇不仅肉质爽脆，味道鲜味，其多糖具有抗氧化及免疫调节等作用。刘振文[19]分析表明鲍鱼菇子实体可溶性总糖（以葡萄糖计）为4.18%。胡晓艳[15]对不同培养料栽培的鲍鱼菇子实体多糖进行检测，结果显示多糖含量为2.25%～6.54%。本试验子实体粗多糖含量为子实体多糖5.97%，三萜含量为1.12%，多糖含量较高。目前，关于盖囊侧耳的资源收集、鉴定和驯化利用较少，盖囊侧耳是侧耳科侧耳属真菌，其栽培技术简单，产量高，而且是一种非常适合夏季高温季节栽培的菇类，因此，利用其选育耐高温新品种有重大学术价值和市场前景。彭学文等[20]利用平菇和鲍鱼菇单核菌丝经原生质体融合获得新品种‘唐平0332’，该菌株出菇整齐、转潮快，比对照生物学效率提高11%。本试验从盖囊侧耳野生菌株的鉴定、生物学特性分析、驯化栽培、子实体商品性和多糖含量分析等系统开展研究，研究结果可为盖囊侧耳的人工栽培及推广应用提供依据，也为后续选育广温、耐高温型食用菌品种提供优良种质资源。