响应面法优化猪鬃草总黄酮提取工艺及抗氧化性研究

基金项目：

贵州省科技厅平台人才项目［20185216］。

作者简介：

陈菊（1979—），女，苗族，硕士，副教授，研究方向为中草药方面教学及基础研究。E-mail：511285737@qq.com

通信作者：

【摘  要】

目的：研究猪鬃草总黄酮提取工艺，分析其抗氧化活性。方法：利用Box-Behnken响应面试验设计优选猪鬃草总黄酮超声波提取工艺的最佳条件，并测定猪鬃草总黄酮提取物对·OH和DPPH自由基的清除能力。结果：猪鬃草总黄酮超声波提取的最优工艺条件为：料液比1∶33 g/mL，超声提取时间21 min，超声次数2次，该条件下总黄酮的提取率为6.17%；抗氧化试验中，猪鬃草总黄酮对·OH和DPPH自由基均有清除效果，对·OH清除率为45.09%，对DPPH清除率为63.12%。结论：Box-Behnken分析法优化猪鬃草总黄酮提取工艺是可行的，猪鬃草总黄酮具有较好的抗氧化能力。

【关键词】

猪鬃草；总黄酮；超声提取；响应面法；抗氧化性

【中图分类号】R284.1    【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2023）20-0044-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.20.zgmzmjyyzz202320010

Optimization of Extraction Process and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Adiantum

capillus-veneris by Response Surface Method

CHEN Ju

Qiandongnan Vocational and Technical College for Nationalities，Kaili 556000，China

Abstract：

Objective The extraction technology and antioxidant activity of total flavonoids from Adiantum capillus-veneris were studied. Methods With Box-Behnken response surface method，the ultrasonic-assisted extraction process parameters of total flavonoids from Adiantum capillus-veneris were optimized .The antioxidant capacity of total flavonoids to·OH and DPPH·free radical were adopted. Results The optimum extraction conditions was as follows： material-liquid ratio 1∶33 （g/mL）， extraction time 20min， extraction times 2 times. Under these conditions， the average extraction rate of polysaccharides reaches 6.17%.The total flavonoids in Adiantum capillus-veneris had good antioxidant effect on·OH radicals and DPPH radicals，and the scavenging rate was 45.09% and 63.12%. Conclusion The response surface method is feasible to optimize extraction process of Adiantum capillus-veneris total flavonoids and the total flavonoid had good antioxidant activity.

Keywords：

Adiantum Capillus-veneris；Total Flavonoids；Ultrasonic-assisted Extraction；Response Surface Methodology；Antioxidant Activity

豬鬃草为铁线蕨科（Adiantaceae）植物铁线蕨（Adiantum capillus-veneris）及团羽铁线蕨（Adiantum capillus-junonis Rupr）［1］，又名猪毛漆、铁丝草、鱼鳞草［2］，常生于溪边隐湿处，广泛分布在贵州境内，其中在贵州省黔东南地区民间常用来治疗尿路感染及结石，具有较好的疗效。猪鬃草性凉，味微苦，以全草入药，可清热祛风、利尿消肿、补肾止咳，用于治疗感冒咳嗽、腰酸背痛、跌打损伤、尿结石、乳腮炎、肾炎、血淋、遗精等［2-6］。据《贵州民间方药集》记载猪鬃草中含黄酮类、糖类、挥发油和鞣质等多种物质。黄酮是药用植物中一类多功能的天然活性物质，具有抗心脑血管病、抗肿瘤、抗糖尿病等作用［7］。由于黄酮类化合物特有的理化性质和特殊结构，使得它能选择性地抑制体内酶的活性，而具有抗氧化性［8］，已经被广泛应用到药品、食品和化妆品中。

响应面分析法是一种能确定多因素系统的试验方法，它采用多元二次回归方程来拟合试验因素与响应值之间的函数关系，并通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数［9］。目前，响应面法优化黔东南地区猪鬃草总黄酮的提取研究未见报道，本研究拟在单因素试验基础上，利用响应面试验设计对超声波提取猪鬃草总黄酮进行优化，并就其清除·OH和DPPH自由基的能力进行研究，为该地区猪鬃草提取物的开发利用提供数据参考和依据。

1  材料与方法

1.1  材料与试剂  猪鬃草购于黔东南州民族药材市场，由我院杨海莉副教授鉴定为铁线蕨科植物铁线蕨，新鲜的猪鬃草用自来水冲掉泥沙，然后在蒸馏水下冲洗干净，再用定性滤纸吸干表面水分，置于110℃烘箱内杀青，60℃下烘干至恒重。烘干后的猪鬃草经粉碎，并过筛，即得猪鬃草粉末，室温下密封保存备用。

主要试剂：标准品芦丁（HPLC＞98%）购于北京中科质检生物技术有限公司，DPPH自由基、 H2O2、维生素C及其他试剂均为分析纯。蒸馏水，实验室自制。

主要仪器：电热鼓风干燥箱（DUG-90764型，上海精宏实验设备有限公司）；紫外可见分光光度计（UV8000S型，上海元析仪器有限公司）；电子分析天平［MS204S型，梅特勒托利多（上海）仪器有限公司］；超声波清洗器（SK8200HP型，上海科导超声仪器有限公司）；数显恒温水浴锅（SYG-6型，常州朗越仪器制造有限公司）；循环水式真空泵［SHZ-D（Ⅲ）型，巩义市予华仪器有限责任公司］。

1.2  试验方法

1.2.1  芦丁标准曲线的制备  准确称取105℃条件下，干燥至恒重的芦丁标准品6.55 mg，加无水乙醇适量使其溶解并定容到20mL容量瓶中，摇匀，得0.3275mg/mL标准溶液。精密吸取上述标准溶液0.00mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL，分别放入25mL的容量瓶中，先各加入0.5mL的5%亚硝酸钠溶液，摇匀并静置6min，再各加入0.5mL的10% 硝酸铝溶液，充分摇匀放置6min，再分别加入5mL的 4%氢氧化钠溶液，最后用70%的乙醇定容至刻度，摇匀。常温下放置15min，然后在500 nm处测定吸光度A值，绘制芦丁标准溶液浓度C（mg/mL）与吸光度A的标准曲线图（如图1所示），计算出回归方程：A=12.837C+0.15，相关系数R=0.999，表明在0.0028～0.0817mg/mL浓度范围内线性关系良好。

1.2.2  猪鬃草总黄酮超声提取工艺及得率计算  准确称取猪鬃草粉末适量，加70%乙醇浸泡30min后，进行超声波提取，过滤，滤液用70%乙醇定容于50mL容量瓶中，摇匀，得样品溶液。精密吸取样品溶液2.00mL，放置于20mL容量瓶中，同“1.2.1节”操作加入5% NaNO2、10%Al（NO3）3和4%的NaOH定容，在510 nm处测定吸光度。根据测得的吸光度和标准曲线回归方程计算猪鬃草中黄酮的含量，然后计算猪鬃草黄酮提取率：

猪鬃草总黄酮提取率（%）=猪鬃草总黄酮质量猪鬃草质量×100%

1.2.3  单因素试验设计  固定提取工艺中其他因素水平，选取料液比（1∶10 g/mL、1∶20 g/mL、1∶30 g/mL、1∶40 g/mL、1∶50 g/mL）、超声提取时间（5min、10min、20min、30min、40min）和超声次数（1次、2次、3次、4次、5次）为影响因素，分别进行单因素试验，考究各单因素变化对总黄酮提取率的影响，以确定响应面试验中各因素取值范围。

1.2.4  响应面优化试验设计  结合单因素试验结果，以料液比（A）、超声提取时间（B）、超声次数（C）为考察因素，各设定3个水平，以-1、0、1分别编码，采用Box提出的中心组合试验设计原理，利用软件进行响应面分析，确定超声提取猪鬃草总黄酮的最优工艺，试验因素和水平设计见表1。

1.2.5  猪鬃草总黄酮抗氧化活性测定

1.2.5.1  对羟基自由基清除能力的测定  参考张琳等［10］的方法稍以改动，将1.2.2节猪鬃草黄酮提取液进行浓缩，用蒸馏水稀释浓缩液并配成0.05mg/mL、0.15mg/mL、0.25mg/mL、0.35mg/mL、0.45mg/mL、0.55mg/mL、0.65mg/mL7个不同浓度的样品溶液，取7支比色管，先各加入2.0mL的 6 mmol/L硫酸亚铁溶液、不同质量浓度的猪鬃草总黄酮溶液及6 mmol/L双氧水溶液，充分摇匀，25℃条件下放置10min后，再加2.0mL 6 mmol/L水杨酸-乙醇溶液，摇匀并放置于37℃水浴条件下反应30min ，然后分别在510 nm测定不同质量浓度总黄酮溶液的吸光度M1；同时测定用蒸馏水代替水杨酸乙醇溶液的吸光度 M2和用蒸馏水代替黄酮溶液的吸光度M0，试验采用维生素C为阳性对照，通过下面公式计算出猪鬃草总黄酮对·OH清除率：

羟基自由基清除率（%）=1-（M1-M2）M0×100%

1.2.5.2  对DPPH自由基清除能力的测定  参考王世彬等［11］的方法，在2.5mL浓度为0.2 mmol/L 的DPPH乙醇溶液中分别加入不同质量浓度的猪鬃草总黄酮溶液2.0mL，摇匀后，在25℃条件下避光反应30min，于紫外-可见分光光度计517 nm波长处测定吸光度N1，同时测定2.5mL无水乙醇与2.0mL不同质量浓度猪鬃草总黄酮溶液混合液的吸光度N2、以及用2.0mL无水乙醇代替样品溶液与2.5mL0.2 mmol/LDPPH溶液反应的吸光度 N0。试验以维生素C为阳性对照，计算猪鬃草总黄酮对DPPH·清除率：

DPPH自由基清除率（%）= 1-（N1-N2）N0×100%

2  結果与分析

2.1  单因素试验分析  单因素料液比、超声时间和超声次数对猪鬃草总黄酮提取率的影响结果如图2所示。

由图2a看出，随着溶剂用量的增加，猪鬃草总黄酮提取率也增加，当料液比达1∶30时，提取率最大，超过1∶30之后，提取率逐渐下降。料液比过大时不但提取溶剂的用量增加，而且不利于浓缩，所以选择料液比在1∶30附近进一步优化试验。

由图2b可知，随着超声提取时间的延长，总黄酮提取率呈增加趋势， 30min后，猪鬃草总黄酮提取率反而下降。这也许是由于超声时间太短，提取不充分，黄酮类化合物还没有完全溶出，但超声时间过长部分溶剂会挥发，同时溶液中的非黄酮类物质逐渐增多，导致提取率下降。因此，选择超声时间在30min左右为宜。

由图2c可知，超声提取1次时，猪鬃草总黄酮提取率明显较低，超声提取2次时提取率达最高，继续增加提取次数，提取率不再增加并开始下降。因此，宜选择提取次数在2次左右。

2.2  响应优化试验结果与方差分析  用自变量A、B、C分别表示料液比（g/mL）、超声提取时间（min）和超声次数3个影响因素，Y为响应值表示猪鬃草总黄酮提取率，采用分析软件设计，共17个试验， 1～12为析因试验，其余13～17五个试验为中心试验。响应面试验设计及结果见表2，方差分析见表3，回归模型可靠性分析见表4。

对表2试验结果进行多项式分析，可建立如下二次多项回归方程：

Y=6.06+0.93A+0.35B+0.35C-0.11AB+0.52AC-0.63BC-1.79A2-0.16B2-0.51C2

表3方差分析显示，模型P<0.0001，表明二次回归方程模型高度显著；失拟项P＝0.1058＞0.05，差异不显著，表明该残差均由随机误差所引起。表4中的回归模型决定系数R2=0.9878，表明98.78%的试验数据是合理的，说明该回归模型与实际测量值拟合得较好。因此可用该回归方程对试验结果进行分析。由表3可知，该二次回归方程的一次项A、B、C和二次项A2、B2、C2均达显著水平以上，交互项中除AB项的交互作用不显著外，其他BC和AC项两项交互作用达也都显著水平。因此，影响超声提取猪鬃草黄酮的主次因素为A＞B＞C，即料液比＞超声提取时间＞超声次数。

根据回归模型拟合结果，通过软件对回归模型进行预测分析，得到猪鬃草总黄酮超声波提取的最佳条件为：料液比1∶33.27g/mL，超声时间20.27min，超声次数2.46 次，此条件下猪鬃草黄酮提取率为6.29%。为方便试验操作，将工艺条件调整为料液比1∶33g/mL，超声时间21min，超声次数2次。在调整后的工艺条件下进行验证试验，重复3次，测得猪鬃草黄酮提取率为6.17%，接近模型预测值，说明预测值与试验值之间具有较好的拟合性，证明了响应面分析法优化猪鬃草总黄酮提取工艺的可行性。

2.3  猪鬃草总黄酮抗氧化活性分析

2.3.1  对·OH自由基的清除效果  由图3可知，在所试质量浓度0.05～0.65mg/mL范围内，羟基自由基的清除率随着总黄酮质量浓度的增加逐渐增强，两者之间成正比例关系，当总黄酮质量浓度为0.55mg/mL时，羟基自由基清除率达最大，为45.09%。与同浓度的维生素C相比较，猪鬃草总黄酮清除·OH自由基的能力虽然弱于维生素C清除·OH自由基的能力，但也具有较好清除·OH自由基的能力。

2.3.2  对DPPH自由基的清除效果  由图4可知，猪鬃草总黄酮在质量浓度0.05～0.65mg/mL范围内，随着猪鬃草总黄酮质量浓度的增加，清除DPPH自由基的能力增强，当总黄酮质量浓度为0.65mg/mL时，对DPPH自由基的清除力可达63.12%。与相同浓度的维生素C相比较，虽然猪鬃草总黄酮清除DPPH自由基的能力没有维生素C清除DPPH自由基的能力强，但猪鬃草总黄酮也具有一定清除DPPH自由基的能力。

3  结论

目前黄酮类物质的提取方法主要有超声波提取法［12］、微波提取法［13］、回流提取法［14］等。鉴于超声波提取法具有提取率高、操作简单、试剂使用量少的优点［15-16］，此次研究采用超声波提取猪鬃草总黄酮。研究考察了料液比、超聲时间、超声次数对猪鬃草总黄酮提取率的影响，并通过响应面分析法建立了影响因素与提取率间的数学模型方程，最终确定了超声波提取猪鬃草总黄酮的最佳工艺参数为：料液比1∶33g/mL，超声时间21min，超声次数2次，在此条件下猪鬃草总黄酮的平均提取率为6.17%，与预测值6.29%接近。

该研究从清除·OH和DPPH自由基的能力研究了猪鬃草总黄酮的抗氧化活性，并以维生素C为阳性对照。结果表明，在猪鬃草总黄酮质量浓度在0.05～0.65mg/mL范围内，随着猪鬃草总黄酮质量浓度的增加，清除·OH和DPPH自由基的能力逐渐增强。当黄酮质量浓度为0.55mg/mL时，对·OH的清除率为45.09%；当黄酮质量浓度为0.65mg/mL时，对DPPH自由基清除率的为63.12%。

综上所述，采用响应面法优化猪鬃草总黄酮的提取工艺是合理可靠的，可用于猪鬃草总黄酮的提取。本研究结果表明，猪鬃草总黄酮具有很好的抗氧化活性，可以作为天然抗氧化剂资源进行开发利用。相关研究结果为猪鬃草总黄酮的提取及抗氧化活性成分的开发提供了科学依据。然而，有关猪鬃草总黄酮体内抗氧化性以及抗氧化作用的机理尚不清楚，有待进一步的研究。

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（收稿日期：202-02-03  编辑：刘  斌）