基于HPLC梯度洗脱-切换波长法测定防芷鼻炎片的6种成分

余清莲

福建省三明市检验检测中心，福建 三明 365000

防芷鼻炎片由苍耳子、野菊花、鹅不食草等十味中药制成，用于治疗慢性鼻炎引起的喷嚏、鼻塞、头痛、过敏性鼻炎、慢性鼻窦[1]。防芷鼻炎片的现行质量标准[2]对性状、化学鉴别做出了相关规定，相关文献主要对苍耳子、白芷、墨旱莲、野菊花、白芍及防风的薄层色谱鉴别[3-5]、HPLC测定芍药苷的含量[6]、HPLC测定欧前胡素、异欧前胡素的含量[7]及RRLC测定蒙花苷、芍药苷的含量[8]等方面展开研究。防芷鼻炎片组方复杂，仅是鉴别、检查、单个成分或两个成分的含量测定难以全面反应该药的质量。因此，实验基于中医方剂配伍组成的基本原则，选取君药苍耳子的质量标志物的绿原酸、咖啡酸[9]，臣药野菊花的质量标志物蒙花苷[10]，臣药白芍的质量标志物芍药苷，佐药防风药效的质量标志物升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷[11]为指标性成分，探索同时测定上述指标成分的含量测定方法，以期为更全面地控制防芷鼻炎片的质量提供科学参考。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 1260高效液相色谱仪(安捷伦公司)；HH-6数显恒温水浴锅(常州荣华仪器制造有限公司)；CPA324S电子分析天平(赛多利斯科学仪器公司)。

1.2 材料 绿原酸 (批号：110831-201906，含量91.5%)、咖啡酸 (批号：110753-201716，含量99.3%)、芍药苷 (批号：110736-201943，含量95.1%)、升麻素苷 (批号110885-201703)、5-O-甲基维斯阿米醇苷(批号：11924-201806，含量99.5%)、蒙花苷(批号：11924-201806，含量99.5%)。甲醇(色谱纯、分析纯)、甲酸(分析纯)、醋酸(分析纯)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：unitary C18柱 (4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)-0.5%醋酸溶液(B)；梯度洗脱(0～10 min：20%A；10～40 min：20%A→35%A；40～55 min：35%A→45%A；55～68 min：45%A→55%A)；流速：1 mL/min；进样体积：10 μL；波长：0～21 min 323 nm、21～30 min 230 nm、30～60 min 254 nm、60 min后 330 nm。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备 取防芷鼻炎片20片，除去糖衣，称取重量后(平均片重为2.993 g)，研磨成细粉，取0.6 g，精密加入甲酸-50%甲醇(1∶20)混合溶液25 mL，称定重量，加热回流2 h，放冷，称重，用甲酸-50%甲醇(1∶20)混合溶液补足失重，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取绿原酸12.86 mg、咖啡酸12.91 mg、芍药苷12.6 mg、升麻素苷15.27 mg、5-O-甲基维斯阿米醇苷10.08 mg、蒙花苷9.51 mg，分别加入甲醇50 mL，配成对照品贮备液。取上述贮备液适量，加甲醇稀释成每mL含绿原酸10.29 μg、咖啡酸3.1 μg、芍药苷100.8 μg、升麻素苷12.216 μg、5-O-甲基维斯阿米醇苷4.032 μg、蒙花苷20.76 μg的混合对照品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性试验[11]精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10 μL，按“2.1”项的条件检测，测定结果如图1、图2所示。在供试品溶液的色谱图上，有与对照品保留时间一致的色谱峰，且色谱报告中显示：各色谱峰的理论塔板数高于6500，分离度高于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之间。表明该方法的系统适用性良好。

图1 供试品溶液色谱图

图2 对照品溶液色谱图

2.3.2 线性关系 精密吸取混合对照品溶液3 μL、6 μL、9 μL、12 μL、15 μL，分别按“2.1”项色谱条件进样测定，以对照品的含有量及相应的峰面积为横、纵坐标，绘制咖啡酸、绿原酸、芍药苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、蒙花苷的标准曲线并进行线性回归。回归方程见表1。

表1 线性回归方程

2.3.3 稳定性试验 分别在0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h精密吸取2.2.1项供试液10 μL，进样测定，绿原酸、咖啡酸、芍药苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、蒙花苷峰面积的RSD分别为1.5%、2.1%、0.9%、1.6%、1.2%、1.8%，供试品溶液24 h内含量稳定。

2.3.4 重复性试验 精密称取防芷鼻炎片细粉6份，每份0.6 g，按“2.2.1”项方法制备6份供试品溶液，在“2.1”色谱条件下测定，每片含绿原酸、咖啡酸、芍药苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、蒙花苷量的平均值(RSD)分别为0.27 mg(1.2%)、0.04 mg(2.0%)、2.1 mg(1.0%)、0.13 mg(1.2%)、0.20 mg(1.6%)、0.61 mg(0.8%)。

2.3.5 精密度试验 连续吸取“2.2.1”项供试品溶6次，每次10 μL，在“2.1”色谱条件下测定，绿原酸、咖啡酸、芍药苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、蒙花苷峰面积的RSD分别为1.0%、1.5%、0.9%、1.0%、0.8%、1.5%。

2.3.6 回收率试验 精密称取已知含量的防芷鼻炎片细粉6份，每份0.3 g，分别精密加入适量的绿原酸、咖啡酸、芍药苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、蒙花苷对照品，依“2.2.1”项的方法制备相当于100%浓度水平的供试液，在2.1色谱条件下测定。对照品加入量及测定结果见表2。

表2 加样回收率实验结果 (n=6)

2.4 样品测定及结果分析 取防芷鼻炎片6批(R厂家：20220101，20230301；T厂家：220202，230101；B厂家：E22S003，E22S001)，依“2.2.1”项下方法制成供试液，在“2.1”项条件下进行检测，6批样品中6种成分的含量测定结果折线图如图3所示。从图中可看出：同一厂家不同批号的样品的各成分的含量差异不显著，而不同厂家生产的样品各成分的含量都有差异，尤其是R厂家的样品中芍药苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷及蒙花苷的含量远高于T和B厂家。

图3 含量测定结果折线图

3 讨论

3.1 样品溶液的制备 溶剂的选择上，分别考察了70%乙醇溶液、100%甲醇溶液、甲酸-50%甲醇(1∶20)混合溶液和甲酸-70%甲醇(1∶20)混合溶液，70%乙醇溶液和100%甲醇溶液对绿原酸、咖啡酸的提取效率低，甲酸-50%甲醇(1∶20)混合溶液对各成分的提取效率明显优于甲酸-70%甲醇(1∶20)混合溶液。提取方式上，比较了超声和加热回流两种方法，与超声提取的样品比较，加热回流提取的样品中，蒙花苷的含量显著提高，其他成分的含量略有提升。这可能与蒙花苷溶解性能有关，温度较高的条件下，其在甲醇中的溶解度升高；基于上述原因，选取甲酸-70%甲醇(1∶20)混合溶液为溶剂，采用加热回流的提取方式。

3.2 流动相及洗脱方式的选择 流动相的选择上，依绿原酸、咖啡酸等6种组分的化学性质，选取甲醇-水、甲醇-0.5%醋酸溶液和甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相考察对象，发现：以甲醇-水为流动相时，样品中绿原酸和咖啡酸峰面积小、峰形不佳；以甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相时，芍药苷和升麻素苷的峰形对称性欠佳；而以甲醇-0.5%醋酸溶液洗脱，6个组分色谱峰的峰形对称，分离度佳，且峰面积均较大；洗脱方式上，因各组分的极性相差较大，等度洗脱需要耗费更多的溶剂和时间，故选择梯度洗脱。综上所述，本实验选取甲醇-0.5%醋酸溶液为流动相，进行梯度洗脱。

3.3 检测波长的选择 通过对防芷鼻炎片供试品溶液进行全波长扫描分析，确定了干扰小、强吸收的波长，分别为323 nm(绿原酸、咖啡酸)、230 nm(芍药苷)、254 nm(升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷)、330 nm(蒙花苷)；查看样品溶液的离线3D(时间、波长、峰面积)视图，发现在21 min、30 min、60 min切换波长，所得的色谱图基线平稳、色谱峰分离度高。

4 结论

使用HPLC梯度洗脱-切换波长法对3个厂家6个批号的防芷鼻炎片进行测定，结果表明，防芷鼻炎片中的6个指标性成分均能在同一个色谱系统中同时出峰，且结果稳定、分离效能高。因此，HPLC梯度洗脱-切换波长法可作为防芷鼻炎片6种成分的含量测定方法。此方法的建立，有利于更全面控制防芷鼻炎片的质量，但仍存在不足。该方法所能测定的指标成分并未覆盖全方，且实验的样本量也较少。因此，今后可结合指纹图谱和药理实验确定更多能反应该药药效的质量标志物，测定覆盖全方中药材的指标性成分含量，探索其成分之间的相关性，建立更高效更全面的含量测定方法。