壮药尖锐湿疣外洗剂的质量标准研究

陈 壮 林忆龙* 韦世民 黄鸿敖 朱 闽 刘雪莹 韦骁娟

1.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530001；2.右江民族医学院药学院，广西 百色 533000；3.广西壮族自治区东兰县人民医院药剂科，广西 东兰 547400

尖锐湿疣(condyloma acuminatum，CA)是常见的性传播疾病之一，临床患者的复发率从9%至80%不等[1]。CA复发仍是临床治疗的一大挑战，寻找更为安全有效的药物用于CA的治疗是亟待解决的问题。壮医药在治疗CA方面一直都有独特的疗效，同时具有毒副作用小、复发率低等优势[2-4]。壮医认为，CA多由外感毒邪，入侵肌肤，龙路、火路失调，外邪凝聚肌肤而致，主要病理因素为毒邪秽浊，故祛毒，通调龙路、火路乃基本治法。壮药尖锐湿疣外洗剂为我院使用多年的临床验方，具有良好的临床效果，但该制剂尚未进行质量标准方面研究。壮药尖锐湿疣外洗剂由马齿苋、鬼针草、白花蛇舌草和白花丹组成[5-7]；马齿苋具有清热毒、调龙路、止血、止痢的功效，鬼针草具有通谷道、解痧毒、清热毒、散瘀毒的功效，二者共为主药；白花蛇舌草可通龙路，解热毒，除湿毒，散结消肿为帮药；白花丹散瘀消肿，祛风除湿，消炎止痛为带药。全方主帮带合用，共奏祛毒、通调火路龙路、凉血除瘀之效，具有祛毒、通调火路、凉血除瘀之功。白花蛇舌草水溶性成分是主要的有效成分，而去乙酰车叶草酸甲酯是其水溶性成分之一[8]。本研究将建立壮药尖锐湿疣外洗剂的HPLC法测定去乙酰车叶草酸甲酯的含量，并采用薄层鉴别法对方中白花蛇草和白花丹进行定性鉴别。本研究建立的方法重现性好，简便、快捷，可有效的控制壮药尖锐湿疣外洗剂的质量标准。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 LC-2030 Plus高效液相色谱仪器(岛津)，Shimadzu Shim-packGIST C18反相色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，AL204电子天平[梅特勒-托利多(上海)有限公司]，KQ-D250超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，101-38数显式电热恒温干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)，WFH-205B可见透身紫外反射仪(上海仪电)。

1.2 材料 去乙酰车叶草酸甲酯对照(批号：111786-201602，纯度：94.3%)、白花蛇舌草对照药材(批号：121183-201605)、白花丹对照药材(批号：121370-200401)均购自于中国食品药品检定研究院；壮药尖锐湿疣外洗剂(批号：20211108、20211109、20211110)，阴性对照洗剂(白花蛇舌草、白花丹)均由广西中医药大学附属瑞康医院自制。甲醇和乙腈(Fisher，色谱纯)，硅胶G薄层板(青岛海洋化工有限公司、烟台市化学工业研究所)；其余试剂均为分析纯试剂。

2 方法

2.1 溶液配制

2.1.1 去乙酰车叶草酸甲酯对照品溶液 精密称取去乙酰车叶草酸甲酯对照品13.50 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇定容到刻度，即得0.5092mg/mL去乙酰车叶草酸甲酯对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液 取壮药尖锐湿疣外洗剂适量，13000转离心10 min，即得。

2.1.3 阴性对照溶液 取白花蛇舌草阴性对照溶液适量，13000转离心10 min，即得。

2.2 色谱条件与系统适用性 试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(4：96)为流动相，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为：236 nm。理论板数按去乙酰车叶草酸甲酯峰计算应不低于3000。

2.3 线性关系考察 精密移取去乙酰车叶草酸甲酯对照品溶液适量，加甲醇分别稀释成浓度为0.2546 mg/mL、0.1273 mg/mL、0.07638 mg/mL、0.03819 mg/mL、0.01910 mg/mL的对照品溶液，取上述5个浓度对照品溶液和原液(0.5092 mg/mL)各进样5 μL，按“2.2”项下色谱条件进行分析。以去乙酰车叶草酸甲酯峰面积为纵坐标(Y)，对照品溶液浓度为横坐标(X)，进行线性回归。

3 结果与分析

3.1 去乙酰车叶草酸甲酯HPLC含量测定方法学考察

3.1.1 专属性考察 取对照品(0.07638 mg/mL)、供试品和阴性对照溶液，按“2.2”项下色谱条件分析，结果显示，样品中其他成分对去乙酰车叶草酸甲酯的测定无干扰(如图1所示)。

A.对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性对照溶液；1.去乙酰车叶草酸甲酯

3.1.2 线性关系考察 以去乙酰车叶草酸甲酯峰面积为纵坐标(Y)，对照品溶液浓度(mg/mL)为横坐标(X)，绘制标准曲线，得到回归方程为：Y= 7.619×106X+ 1.772×104(R2=0.9999)，表明去乙酰车叶草酸甲酯在0.01910～0.5092 mg/mL 范围内线性关系良好。

3.1.3 精密度考察 精密吸取同一浓度的去乙酰车叶草酸甲酯对照品溶液5 μL，按“2.2”项下色谱条件分析，连续进样6次，结果测得去乙酰车叶草酸甲酯的峰面积RSD值为0.21%，表明该方法精密度良好。

3.1.4 重复性考察 取同一批号的尖锐湿疣外洗剂6份，按照“2.1”项下方法制成供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样分析。测得去乙酰车叶草酸甲酯的含量RSD值为2.90%，表明该方法重复性良好。

3.1.5 稳定性考察 取同一供试品溶液，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h进样，按“2.2”项下色谱条件分析，测定去乙酰车叶草酸甲酯的含量。结果测得去乙酰车叶草酸甲酯的含量RSD值为3.58%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

3.1.6 加样回收试验 取已知含量的壮药尖锐湿疣外洗剂0.5 mL，精密移取，加入去乙酰车叶草酸甲酯对照品适量，混匀，按“2.1”项下平行制备6份供试品溶液，分别精密吸取5 μL，按“2.2”项下色谱条件下测定，并计算回收率。结果见表1，去乙酰车叶草酸甲酯平均回收率为100.27%，RSD为3.32%。

表1 去乙酰车叶草酸甲酯加样回收表

3.2 三批样品测定 制备三批壮药尖锐湿疣外洗剂(如图2)，每批次取样品2份，分别按“2.1”方法制备供试品溶液，按“2.2”色谱条件进样5 μL，以外标法计算得到去乙酰车叶草酸甲酯的平均含量。见表2。

图2 三批壮药尖锐湿疣外洗剂样品图

表2 三批产品去乙酰车叶草酸甲酯平均含量表(n=2)

3.3 TCL定性鉴别结果

3.3.1 白花丹薄层鉴别[9]取壮药尖锐湿疣外洗剂5 mL，水浴蒸干，加甲醇溶解，制成1 mL供试品溶液。取白花丹阴性对照溶液5 mL同法制得阴性对照溶液。另取白花丹对照药材样品1 g，加甲醇10 mL，超声处理30 min，取续滤液作为对照药材溶液。按照《中华人民共和国药典》 (通则0502)[10]试验，分别吸取供试品和阴性对照溶液3 μL，对照药材溶液8 μL点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90 ℃)-三氯甲烷-甲醇(8∶4∶1)为展开剂，预饱和10 min，展开，取出晾干，喷2%三氯化铝乙醇溶液，在105 ℃下加热2 min，置于紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱显相应的位置上，显相同颜色荧光斑点，阴性对照无干扰。如图3所示。

1～3.供试品(20211108、20211109、20211110)；4.白花丹对照药材；5.阴性对照

3.3.2 白花蛇舌草薄层鉴别[11]取壮药尖锐湿疣外洗剂25 mL，水浴蒸干，加丙酮20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，加乙醇溶解，制成1 mL供试品溶液。取白花蛇舌草阴性对照溶液25 mL同法制得阴性对照溶液。另取白花蛇舌草对照药材0.5 g，丙酮20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，加乙醇溶解，制成1 mL对照药材溶液。按照《中华人民共和国药典》(通则0502)[10]试验，分别吸取供试品和阴性对照溶液10 μL，对照药材溶液4 μL点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮(7∶1)为展开剂，预饱和15 min，展开，取出晾干，喷10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃下加热至斑点清晰，日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱显相应的位置上，显相同颜色斑点，阴性对照无干扰。如图4所示。

1～3.供试品(20211108、20211109、20211110)；4.白花蛇舌草对照药材；5.阴性对照

4 讨论

4.1 色谱指标成分的选择 壮药尖锐湿疣外洗剂是以水为溶媒的制剂，在选择HPLC测定尖锐湿疣外洗剂成分时，考虑选取白花蛇舌草的水溶性成分：4-香豆酸和去乙酰车叶草酸甲酯[8]，但处方中其它药材也含有4-香豆酸，故制定质量标准时只选择了去乙酰车叶草酸甲酯。

4.2 薄层色谱的考察 在白花丹薄层鉴别研究时，对展开系统和显色剂浓度进行了考察，石油醚(30～60 ℃)-乙酸乙酯-冰醋酸(20∶2∶1)、石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-甲酸(30∶4∶1)为展开剂，预饱和10 min展开，供试品都均未出现与对照药材相同的斑点。调整展开剂比例为石油醚(30～60 ℃)-三氯甲烷-甲醇(8∶4∶1)，发现供试品和对照药材斑点Rf值明显偏大，斑点边缘轮廓不清晰，最终确定展开剂为石油醚(60～90 ℃)-三氯甲烷-甲醇(8∶4∶1)后，供试品色谱斑点清晰，分离度好。考察了显色剂的浓度，5%三氯化铝乙醇溶液显色会覆盖荧光斑点，2%三氯化铝乙醇溶液显色较好。同时，课题组对白花丹薄层鉴别的方法进行了温度、不同品牌薄层板等耐用性考察，发现供试品斑点色谱均与对照药材相应的位置上显相同颜色的谱斑点。

在对白花蛇舌草进行薄层鉴别研究时，考察不不同展开系统，首先对甲苯-丙酮-冰醋酸(10∶2∶0.2)展开系统考察，发现供试品色谱中，有阴性干扰，之后调整为甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(8∶1.6∶0.2)，甲苯-乙酸乙酯-甲酸(20∶0.8∶0.5)，结果Rf值太大。调整三氯甲烷-丙酮(7∶1)展开系统后，结果Rf值适中且无阴性干扰，故选择三氯甲烷-丙酮(7∶1)为白花蛇舌草鉴别的展开剂。我们对白花蛇舌草薄层鉴别的方法进行了温度、不同品牌薄层板等耐用性考察，发现供试品斑点色谱均与对照药材相应的位置上显相同颜色的谱斑点。

对处方中的马齿苋也进行了薄层鉴别研究，研究时发现马齿苋薄层鉴别有阴性干预，尝试多个展开系统均未能排除干扰，故未列入质量标准中。因方中的鬼针草缺乏对照药品，未进行薄层鉴别研究。

综上所述，本研究建立了壮药尖锐湿疣外洗剂中白花丹和白花蛇舌草的薄层鉴别，以及水溶性成分去乙酰车叶草酸甲酯的HPLC含量测定方法。其中乙酰车叶草酸甲酯含量测定方法经验证，专属性、精密度、重复性、准确度和线性与范围均符合相关要求，可用于壮药尖锐湿疣外洗剂的质量控制研究。