超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法(UHPLC-MS/MS)测定松茸中麦角甾醇含量*

曹燕妮，华 蓉，游金坤，代秋琼，孙达锋，**

（1.云南省食用菌产业发展研究院，云南 昆明 650221；2.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；3.云南云菌科技（集团）有限公司，云南 昆明 650221）

松茸 [Tricholoma matsutake（S. Ito & S. Imai）Singer] 是一种稀有的食（药） 用真菌，隶属于担子菌门（Basidiomycota） 蘑菇纲（Agaricomycetes） 蘑菇目（Agaricales） 口蘑科（Tricholomataceae） 口蘑属（Tricholoma），被誉为“菌中之王”[1]。国内松茸主要分布于吉林、云南、四川和西藏地区[2]。

松茸菌肉肥厚、鲜嫩爽滑，富含蛋白质、脂肪、氨基酸（全部必需氨基酸和10 多种非必需氨基酸），以及多糖、糖醇、萜类、皂苷、甾类、油脂、香豆素、生物碱、微量元素、维生素等多种物质，具有很高的营养价值和药用价值[3-6]。

麦角甾醇（ergosterol） 又称麦角固醇，是真菌类的特征甾体，是真菌细胞膜中最丰富的天然脂质，是构成真菌细胞膜的重要组分，在确保细胞膜结构完整性、膜通透性、物质运输、细胞活力等方面具有重要的生物学作用[7-8]。研究发现麦角甾醇具有免疫调节、预防心血管疾病、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降血脂、利尿等功效[9-10]。

目前麦角甾醇的检测方法主要有紫外分光光度法、薄层色谱扫描法、高效液相色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法-串联质谱法、定量核磁共振法[11-12]。目前，文献中食用菌麦角甾醇的检测主要集中于香菇（Lentinula edodes）、白玉菇（Hypsizygus marmoreus）、姬松茸（Agaricus blazei）、黑木耳（Auricularia heimuer）、鸡油菌（Cantharellus cibarius）、茶树菇（Cyclocybe chaxingu）、冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）、灵芝（Ganoderma lingzhi）等常见的食（药） 用菌，关于松茸中麦角甾醇的检测报道较少。基于超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法高灵敏度、高效分离能力的优势，通过液相色谱、质谱条件优化和方法学评价，建立UHPLC-MS/MS 法快速测定松茸中麦角甾醇含量的方法，旨在为松茸中有效成分的质量评价和深入研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

松茸采购于云南丽江市、香格里拉市、弥渡县、双柏县、巍山县、鹤庆县、牟定县、剑川县、姚安县、南华县、楚雄彝族自治州中山镇等11 个地区。收集样品后于50 ℃烘干，粉碎过80 目筛后备用。

麦角甾醇（纯度≥98%），上海源叶生物科技有限公司；甲醇（色谱纯），上海安谱实验科技股份有限公司；无水乙醇（色谱纯），上海麦克林生化科技有限公司；无水乙醇（分析纯），天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.2 仪器与设备

TSQ Fortis 三重四极杆液质联用仪（APCI 源），赛默飞世尔科技公司；电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；T-214 型电子天平，美国丹佛仪器公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液配制

标准储备液：精确称取麦角甾醇标准品10.0 mg（精确至0.1 mg），用无水乙醇（色谱纯） 溶解后定容至10 mL，即得到麦角甾醇质量浓度为1 mg·mL-1的标准储备液。

标准中间液：准确移取1.00 mL 麦角甾醇标准储备液，使用无水乙醇（色谱纯） 稀释并定容至100 mL，即得到麦角甾醇质量浓度为10 μg·mL-1的标准中间液。

标准系列工作液：吸取麦角甾醇标准中间液50、100、200、400、600、800、1 000 μL，使用无水乙醇（色谱纯） 稀释并定容至10 mL，摇匀，得到麦角甾醇质量浓度分别为50、100、200、400、600、800、1 000 ng·mL-1的标准系列工作液，临用时配制。

1.3.2 松茸样品前处理

准确称取松茸样品0.2 g 于100 mL 平底烧瓶中，加入40 mL 无水乙醇（分析纯），于80 ℃恒温水浴中回流1 h[13]。回流完成后冰浴冷却，将提取液全部转移至50 mL 容量瓶中，用无水乙醇（分析纯） 定容，离心后取上清液过0.45 μm 有机相滤膜作为待测液。不加试样，按同一操作方法做空白试验，每个样品3 次重复。

1.3.3 仪器条件

液相色谱条件：选用Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流速为0.3 mL·min-1；柱温为30 ℃；进样量为5 μL；选取100%甲醇、96%甲醇、100%乙腈3 种流动相。

质谱检测条件：选用大气压化学电离（APCI） 为离子源，正离子模式扫描，采用选择反应监测（SRM），电晕放电电流4 μA，离子传输管温度350 ℃，雾化温度300 ℃，鞘气30 Arb，辅助气10 Arb。

1.3.4 方法学验证

1） 线性范围和检出限试验。将1.3.1 中的标准系列工作液采用1.3.3 中的仪器条件进行测定，以工作液浓度为横坐标，相应峰面积为纵坐标，计算标准曲线，求线性回归方程。

参照标准《环境监测分析方法标准制订技术导则》（HJ 168-2020）[14]附录A 中A.1.1 方法确定麦角甾醇的检出限。

2） 精密度试验。在线性范围内配制高（700 ng·mL-1）、中（370 ng·mL-1）、低（95 ng·mL-1） 3 个浓度的标准品溶液，每个浓度6 次重复，测定麦角甾醇浓度，计算相对标准偏差RSD（relative stardard deviation，RSD）。

3） 重复性试验。称取0.2 g 弥渡县松茸试样6份，按照1.3.2 制备样品溶液，测定麦角甾醇含量并计算相对标准偏差（RSD）。

4） 加标回收率试验。称取0.1 g 弥渡县松茸试样9 份，按照样品麦角甾醇含量的80%、100%和120%添加标准品进行加标回收试验，每个添加量3次重复，按照1.3.2 制备样品溶液，测定麦角甾醇含量并计算加标回收率。

1.3.5 样品中麦角甾醇含量计算

试样中麦角甾醇含量（X，mg·g-1） 的计算公式为：

式中：c 为标准曲线计算得到的试液中麦角甾醇的浓度（ng·mL-1）；V 为试液的定容体积（mL）；f 为试液稀释倍数；m 为试样的质量（g）。

2 结果与分析

2.1 HPLC-MS/MS 法检测条件的优化

2.1.1 液相条件优化

采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm） 为固定相，选用相同浓度的标准品进样，比较了3 种不同流动相的洗脱效果。结果表明，采用100%甲醇作为流动相时，目标物离子峰响应强度较高，峰宽小、峰型更窄更尖锐，选择100%甲醇作为流动相。麦角甾醇标准品色谱图详见图1。

图1 麦角甾醇标准品色谱图Fig.1 Chromatogram of ergosterol standard

2.1.2 质谱分析参数优化

麦角甾醇分子式为C28H44O，分子量为396.339，极性相对较弱，因此选择大气压化学电离（APCI）作为离子源。麦角甾醇在质谱一级扫描中主要生成[M+H-H2O]+准分子离子峰质核比为379.379，获得的麦角甾醇一级质谱扫描图谱见图2。母离子信号稳定后，进行子离子扫描，获得的二级质谱扫描图谱见图3。质谱检测参数见表1。

表1 质谱检测参数Tab.1 Mass spectrometry detection parameter

图2 麦角甾醇一级质谱离子扫描图谱Fig.2 First-order mass spectra of ergosterol

图3 麦角甾醇二级质谱离子扫描图谱Fig.3 Second-order mass spectra of ergosterol

由图2、图3 和表1 可知，麦角甾醇母离子质荷比为379.379，轰击产生的离子碎片较多，根据信号强度和干扰程度，选择二级特征离子质荷比为69.05、125.08、309.25，选择麦角甾醇的定量离子对质荷比为379.379/69.05，定性离子对质荷比为379.379/125.08 和379.379/309.25。

样品进行前处理后，按照优化的检测条件得到松茸样品中麦角甾醇的色谱图见图4。

图4 松茸样品中麦角甾醇色谱图Fig.4 Chromatogram of ergosterol in Tricholoma matsutake sample

由图4 结果表明，样品中麦角甾醇在2.49 min出峰，与标准品保持一致，色谱图基线平稳，峰型对称尖锐，峰前有少量杂峰，但不影响麦角甾醇的定性和定量分析。

2.2 线性范围和检出限

将标准系列工作液按照优化的检测条件测定，进行线性回归分析，得到回归方程Y=56.97X-553.5，相关系数R2=0.999 6。结果表明，在质量浓度50～1 000 ng·mL-1范围内，标准品麦角甾醇浓度与峰面积线性关系良好，符合方法学要求。

空白试验中未检出目标物，计算得出检出限为5 ng·mL-1，定量限为20 ng·mL-1。

2.3 精密度试验

配制标准品溶液按照优化的检测条件测定麦角甾醇含量，精密度试验结果见表2。

表2 精密度试验结果Tab.2 Test results of precision

由表2 可知，3 个浓度的RSD 值依次为2.76%、1.49%、1.45%，说明仪器精密度良好。

2.4 重复性试验

6 份松茸试样按照优化的检测条件测定麦角甾醇含量，重复性试验结果见表3。

表3 重复性试验结果Tab.3 Test results of repeatability

试验结果表明，6 次平行试验结果的RSD 值为1.83%，说明该方法具有良好的重复性。

2.5 加标回收率

3 个不同麦角甾醇添加量的加标试样按照优化的检测条件测定麦角甾醇含量，加标回收率试验结果见表4。

表4 加标回收率试验结果Tab.4 Test results of recovery rate

由表4 可知，3 个不同添加量的平均加标回收率为90.1%～98.5%，RSD 值为1.57%～2.49%，说明该方法具有良好的回收率。

2.6 样品分析结果

根据上述试验条件，测定云南11 个不同产地松茸的麦角甾醇含量，结果见表5。

表5 不同产地松茸中麦角甾醇的含量Tab.5 The content of ergosterol in Tricholoma matsutake from different regions

由表5 可知，云南11 个地区松茸子实体中麦角甾醇的含量为3.677 2～4.497 8 mg·g-1，平均含量为4.140 0 mg·g-1，不同产地松茸麦角甾醇含量的变异系数为7.3%，其中巍山县松茸麦角甾醇含量最高，楚雄州中山镇松茸的含量最低。

3 讨论与结论

食用菌麦角甾醇常用的提取方法有闪式提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、加压溶剂萃取法、超临界流体CO2萃取法等[15]。供试样品前处理采用无水乙醇回流提取，操作简便、重复性好、成本低，但耗时较长，在下一步研究中可以进行提取方法的改进。

采用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱（UHPLC-MS/MS），通过液相、质谱条件优化，建立了一种适用于松茸中麦角甾醇检测的方法，并进行方法学考察。方法验证表明，该方法在质量浓度为50～1 000 ng·mL-1时线性关系良好，重复性好、准确度高，麦角甾醇的检测特异性良好。试验结果显示，该方法可在5 min 内完成麦角甾醇的检测，检出限低、灵敏度高，在一定程度上提高了样品分析效率，可以快速、准确的测定松茸中麦角甾醇的含量。