不同栽培料配方对野生桑黄子实体生长特性的影响*

杜成志，赵 岑，吕 军，王晓军，吴倩倩，武恩斯，李岩杰，张兰迎

（聊城市农业科学院，山东 聊城 252000）

桑黄（商品名） 一般包括锈革孔菌科（Hymenochaetaceae） 桑黄孔菌属（Sanghuangporus） 真菌。近年，随着粗毛纤孔菌（Inonotus hispidus） 等药用菌药理作用的深入研究，逐步将粗毛纤孔菌列为桑黄的1 个种[1]。粗毛纤孔菌原隶属于担子菌门（Basidiomycota）伞菌纲（Agaricomycetes） 锈革孔菌目（Hymenochaetales） 锈革孔菌科纤孔菌属（Inonotus）[2]。其子实体一年生，单生或叠生，无菌柄，盖形；鲜品无嗅无味，革质至软木栓质，干后木栓质[3]。粗毛纤孔菌子实体是我国传统中药材桑黄的重要来源，在东北地区主要用于治疗消化不良等胃病[4-5]。现有研究表明，桑黄所含的多糖、三萜类、酚类、黄酮类等生物活性物质有明显的药理作用和临床功效，主要用于治疗各种癌症、糖尿病、痛风、关节炎等[6-7]。

聊城市临清市黄河故道古桑园中拥有丰富的野生桑黄资源[8]。课题组经野外采集、驯化，筛选出较适宜人工栽培的桑黄菌株，并通过筛选得到最佳菌株和最佳配方，试验结果可为实际生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试桑黄菌株L1 和L2，为聊城市农业科学院野外采集种，经鉴定为粗毛纤孔菌Inonotus hispidus。

1.2 主要试剂

无水葡萄糖标准品（纯度99.4%），坛墨质检科技股份有限公司；蒽酮（AR），上海麦克林生化科技股份有限公司；硫酸（AR）、无水乙醇（AR）、乙酸乙酯（AR）、香草醛（AR）、高氯酸（AR）、冰醋酸（AR），上海沪试实验室器材股份有限公司；齐墩果酸标准品（纯度98%），北京索莱宝科技有限公司；甲醇（AR），西陇科学股份有限公司。

1.3 主要仪器

JY1003 电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；DHG-9075A 鼓风干燥箱，上海恒一科学仪器有限公司；TU-1901 紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；HH-S6 恒温水浴锅，常州国宇仪器制造有限公司；ZNHW-150 智能调温电加热套，河南巩义高科仪器有限公司；KH30R-Ⅱ高速冷冻离心机，湖南凯达科学仪器有限公司；SY-360 超声波清洗仪，上海宁商超声仪器有限公司。

1.4 培养基配方

1.4.1 分离活化培养基配方

分离活化培养采用加富型PDA 培养基，含马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、 KH2PO23 g、MgSO41.5 g、麸皮10 g，水1 000 mL。

1.4.2 原种培养基配方

原种培养基配方为柞木屑72%、麸皮13%、玉米粉12%、红糖1%、石膏1%、石灰1%。

1.4.3 栽培料配方

分别采用了2 个栽培料配方。配方C1 为桑木屑77%、麸皮10%、玉米粉10%、红糖2%、石膏1%；配方C2 为桑木屑58%、棉籽壳20%、麸皮12%、玉米粉4%、豆粕3%、红糖1%、石灰1%、石膏1%。

1.5 试验方法

1.5.1 菌种活化

将保藏菌种接种于加富型PDA 培养基上活化，经二次转接后备用。

1.5.2 原种制备

按照原种配方备料，主料于泡料桶中浸泡12～24 h 后，沥水，与辅料一起混匀，静置5～10 h 后再次翻料，培养料含水量为63%左右。将培养料装入14 cm×27 cm×0.05 mm 的聚丙烯袋中进行高压灭菌。待菌袋冷却后分别接入试验母种，放入发菌室内进行发菌培养。保持发菌室温度为24 ℃，避光培养45 d，待菌丝满袋后使用。

1.5.3 栽培种制备

将C1 和C2 两种配方所需原料分别按比例混匀，预处理方法同1.5.2 所述。控制栽培料含水量为63%左右，用18 cm×35 cm×0.05 mm 的聚丙烯袋装袋，每袋湿质量为1.3 kg。将菌袋进行高压灭菌，待冷却后分别接入试验菌种，放入发菌室内进行发菌培养。保持发菌室温度为24 ℃，避光培养55～60 d，待菌丝满袋再后熟培养25 d 后使用。

1.5.4 试验设计

试验共设计4 个处理，即L1C1、L1C2、L2C1、L2C2，每个处理3 次重复，每个重复做7 袋，每个处理共21 袋。

1.5.5 出菇管理和采收

将菌包按随机区组设计摆放在出菇棚内地面上，保持棚内温度为23～28 ℃，避免阳光直射，打开风口适当通风，在地面水沟适当进行灌水，保持空气湿度为90%～95%。记录原基形成时间；出菇后，观察并记录子实体生长情况。待子实体开始喷粉即为成熟，此时可以采收。试验共采收2 潮子实体并统计产量、生物学效率等。

1.6 桑黄有效成分检测

1.6.1 粗多糖的检测

1） 提取粗多糖。称取桑黄样品粉末2 g，置于圆底烧瓶中，加水60 mL，静置1 h；加热回流4 h，趁热过滤；用少量热水洗涤过滤器和滤渣；滤渣重复以上操作，合并滤液后水浴蒸干。蒸干后所得固体物质先用5 mL 水溶解，之后边搅拌边滴加乙醇至75 mL，摇匀，在4 ℃条件下静置12 h，离心后去上清液；沉淀用热水溶解，随后转移至50 mL 容量瓶中；冷却后加水定容，摇匀。取上述溶液适量，离心，精密量取3 mL 上清液于25 mL 容量瓶中加水定容，摇匀即得桑黄样品粗多糖提取液。

2） 绘制葡萄糖标准曲线。精密称取无水葡萄糖标准品，加水配制质量浓度为0.12 mg·mL-1的葡萄糖标准品溶液。精确量取上述葡萄糖标准品溶液0、0.2、0.6、1.2、1.6、2.0 mL，分别置于10 mL 具塞试管中，加水至2.0 mL。迅速加入6 mL 硫酸蒽酮溶液，摇匀，静置15 min，冰浴15 min 后取出。用紫外可见分光光度法，在625 nm 波长处分别测定标准品吸光度，以质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。

3） 测定粗多糖含量。精确量取上述1） 中得到的样品粗多糖提取液2.0 mL，置于10 mL 具塞试管中，按照绘制葡萄糖标准曲线的方法，在625 nm波长处测定样品溶液吸光度。根据标准曲线计算出粗多糖含量。

1.6.2 三萜的检测

1） 提取三萜。取桑黄样品粉末2 g，置于具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，超声处理（功率140 W，频率42 kHz） 45 min；冷却后过滤至100 mL 容量瓶中；用适量甲醇分次洗涤过滤器和滤渣；滤液并入上述容量瓶中，加甲醇定容，摇匀即得桑黄样品三萜提取液。

2） 绘制齐墩果酸标准曲线。精密称取齐墩果酸标准品，加甲醇配制质量浓度为0.2 mg·mL-1的齐墩果酸标准品溶液。精确量取上述齐墩果酸标准品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分别置于15 mL具塞试管中；挥发干，置冷；精确加入新配制的香草醛冰醋酸溶液（精密称取香草醛0.5 g，加入冰醋酸使其溶解，定容至10 mL 即得） 0.2 mL、高氯酸0.8 mL，摇匀；70 ℃水浴加热15 min，冰浴5 min后取出。精确加入乙酸乙酯4 mL，摇匀。用紫外可见分光光度法，在546 nm 波长处分别测定标准品溶液吸光度，以质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制齐墩果酸标准曲线。

3） 测定三萜含量。精密量取桑黄样品三萜提取液0.2 mL，置于15 mL 具塞试管中，按照绘制齐墩果酸标准曲线的方法，在546 nm 波长处测定样品吸光度。根据标准曲线计算出三萜的含量。

1.7 数据统计与分析

试验数据采用Excel 和SPSS 18 进行统计与分析，结果为3 次重复的平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 不同处理中桑黄子实体的生长时间

不同栽培料配方对不同野生桑黄子实体生长时间的影响情况详见表1。

表1 不同处理中桑黄子实体的生长时间Tab.1 Fruit body growth time of Phellinus igniarius in different treatments

由表1 可以看出，4 个处理中原基形成时间相差不大，但是同一配方条件下，菌株L1 较菌株L2现原基时间和子实体成熟时间短，说明菌株L1 结实能力较菌株L2 强。对于同一菌株来说，配方C2 较配方C1 中桑黄子实体现原基时间和子实体成熟时间都短，说明配方C2 较配方C1 更适宜桑黄生长。吴亚召等[9]在研究中发现，在桑木屑中加入一定量的棉籽壳，对促进桑黄菌丝生长及提高子实体产量有一定的促进作用。本试验结果与其结论一致，可能是因为棉籽壳具有较好的保水性，在出菇过程中能减少菌包内的水分流失，并均衡栽培袋内的营养，从而延长子实体生长时间。

2.2 不同处理中桑黄的生长特性

不同栽培料配方对不同野生桑黄生长特性的影响情况详见表2。

表2 不同处理中野生桑黄的生长特性Tab.2 Growth characteristics of wild Phellinus igniarius in different treatments

由表2 可知，不同栽培料配方对桑黄子实体的生长特性及子实体形态有一定的影响。L1C2 处理中桑黄子实体各项指标表现最优，每袋平均产量达25.2 g（干质量），且子实体形状较好；平均生物学效率达30%；一潮菇出菇率最高，为100%。对同一菌株而言，配方C2 较配方C1 对桑黄子实体生长更有利；而在同一配方条件下，菌株L1 在一潮菇出菇率方面占有明显的优势。子实体形态特征见图1。

图1 不同处理中桑黄子实体的形态Fig.1 Fruit body morphology of Phellinus igniarius in different treatments

2.3 不同处理中桑黄有效成分的含量

不同栽培料配方对不同野生桑黄有效成分含量的影响情况详见表3。

表3 不同处理中野生桑黄有效成分的含量Tab.3 Content of active ingredients in wild Phellinus igniarius in different treatments

从表3 可以看出，L1C2 处理子实体中粗多糖含量最高，达2.05%；L1C1 处理桑黄子实体中粗多糖含量最低，为0.79%。L1C1 处理桑黄子实体中三萜含量最高，为2.71%；L2C1 处理桑黄子实体中三萜含量最低，为1.92%。比较2 个菌株子实体中三萜和粗多糖的含量，发现菌株L1 的三萜含量相对较高而粗多糖含量相对较低，L2 的粗多糖含量相对较高而三萜含量相对较低。说明菌株L2 和L1 在子实体形成过程中，代谢通路相差较大。比较2 个配方栽培的子实体，发现三萜含量差异不大，配方C2 栽培的子实体中粗多糖含量相对较高。说明配方C2 更有利于桑黄次级代谢产物的形成。

3 结论和讨论

通过试验筛选出最佳桑黄菌株为L1，该菌株的优势主要表现在出菇率高，子实体中三萜含量高；最佳配方为C2（桑木屑58%、棉籽壳20%、麸皮12%、玉米粉4%、豆粕3%、红糖1%、石灰1%、石膏1%），该配方条件下桑黄出菇率高、子实体中粗多糖含量高。L1C2 处理为本次试验的最佳处理，桑黄原基形成时间为6 d，子实体成熟时间为46 d，生长周期最短；每袋平均产量为25.2 g（干质量）；生物学效率为30%；子实体中三萜含量为2.24%，粗多糖含量为2.05%；一潮菇出菇率达100%，二潮菇出菇率也最高，为66.7%，其他处理均未超过50%。

试验中发现，不同的野生桑黄菌株栽培特性差异较大，表现为部分菌株更适宜人工栽培，能耐受高氮源营养配方，子实体形态好、产量高，子实体中有效成分含量也较高；部分菌株则不适宜人工栽培，子实体形态差、产量低，子实体中有效成分含量低。不同的栽培料配方对桑黄生长特性具有一定的影响，在桑木屑配方中加入适量的棉籽壳有利于桑黄产量的提高，延长出菇期。