羊肚菌2 种病害病原菌的分离与鉴定*

高章会，华 蓉，孙达锋，刘绍雄，岳万松，张晓华，余锁姝，李建英**

（1.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2.云南省食用菌产业发展研究院，云南 昆明 650221；3.保山市科学技术情报研究所，云南 保山 678099）

羊肚菌（Morchella spp.） 隶属于羊肚菌科（Morchellaceae） 羊肚菌属（Morchella），是一类味道鲜美、脂肪含量低、营养价值高的食用菌。羊肚菌富含蛋白质、多种矿物质、维生素、多糖、甾醇、多酚、蛋白水解物等，具有降血脂、抗疲劳、调节免疫力、抗氧化、保肝护肝、降血糖等作用[1-3]。野生羊肚菌在我国分布广泛，在云南、河南、西藏、山西、四川、陕西、甘肃、新疆等地均有分布，但野生资源数量稀少，因此需开展人工栽培以满足市场需求。羊肚菌主要采用大棚栽培，但在栽培过程中仍容易受外界环境和人为栽培技术等因素的影响，且栽培时需要在土壤厢面摆放一定量的营养袋以提供其生长所需的营养，但这样也为其他病原菌的生长和繁殖提供了有利的条件[4-5]，导致羊肚菌病害问题日益凸显。

近年来，关于羊肚菌病害的研究报道较多。比如，刘伟等[6]研究了羊肚菌软腐病和红体病细菌性病害及蛛网病等真菌性病害，并给出了防控这些病害的方法。GUO 等[7]研究了梯棱羊肚菌（Morchella importuna） 的柄腐烂病的引起原因和防治措施。余苗等[8]研究了羊肚菌白腐病，发现是由曲霉属（Aspergillus） 真菌引起的。HE 等[9]报道了羊肚菌白霉病是由长毛拟青霉（Paecilomyces penicillatus） 引起的。白霉病和蛛网病是羊肚菌栽培中较为常见且危害较大的2 种病害。白霉病表现为子实体菌柄、菌盖或整体感染白色绒毛状菌丝。蛛网病先是在子实体基部菌柄长出绒毛状的菌丝，然后向菌盖蔓延，菌丝逐渐呈棉絮状。目前关于羊肚菌白霉病的研究报道较多，但羊肚菌蛛网病的研究相对较少。本次，针对中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所晋宁基地和泸水市老窝镇羊肚菌栽培基地，开展白霉病和蛛网病的病害调查和病原菌研究，分析病害发生的规律和原因，并进行了病原菌的鉴定等研究，对后期针对性地进行病害防治具有重要作用。

1 材料与方法

1.1 采样点概况及样品采集

1.1.1 采样点概况

以中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所羊肚菌栽培基地（102°34′11.27″E，24°33′42.35″N，海拔1 961.6 m） 以及泸水市老窝镇羊肚菌栽培基地（99°4′2.56″E，25°53′2.62″N，海拔1 856.2 m），作为羊肚菌病害调查及病原菌的采集样点。

1.1.2 样品采集

采样时间为2023 年1 月至2 月，调查并记录羊肚菌发病时间、规律、特征及防治措施等信息，同时采集发生病害的羊肚菌子实体，将采集的标本进行编号后装入9 号自封袋，带回实验室开展后续试验。

1.2 病原菌分离、纯化与鉴定方法

1.2.1 病原菌分离与纯化方法

在超净操作台上，用经酒精灯烧过冷却后的无菌接种针，在羊肚菌子实体病害处挑取病原菌组织放在PDA 培养基平板（60 mm） 上，置于25 ℃培养箱中培养2～7 d。之后挑取菌落的尖端菌丝放在PDA 培养基上进行培养，以此方法纯化3～6 次。最后将纯化好的单菌落转入斜面试管，待试管长满后，再置于4 ℃冰箱内保存备用。

1.2.2 病原菌形态鉴定方法

在无菌条件下，将纯化后的病原菌接种于PDA平板培养基上培养。每隔2 d 观测记录菌丝生长速度、菌落颜色、大小及形态变化等特征，培养7 d后挑取菌落并制成临时玻片，在电子显微镜下观测其菌丝形态、分生孢子梗、分生孢子形状、大小等性状，并进行拍照记录。

1.2.3 病原菌分子鉴定方法

采用rDNA ITS 序列分析[10-11]，采用磁珠法基因组DNA 提取试剂盒（武汉纳磁生物科技有限公司）提取菌丝的基因组DNA，用琼脂糖凝胶电泳法和生物分光光度计法检测DNA 的纯度和浓度。使用ITS通用引物ITS4、ITS5 进行PCR 扩增。PCR 完成后，加（6×） 上样缓冲液（6×） 5 μL 混匀，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。检测合格后，进行测序。将获得的ITS 序列，使用BLAST 软件在NCBI 数据库进行同源性比对，同时，使用MEGA 7 软件构建NJ 系统发育树，使用默认参数，Bootstrap 检验为1 000 次，以此来确定病原菌的系统发育地位。

所设计的进水流道水力损失测试装置为一立式循环系统，如图3所示。由1台200mm口径的惯流管道泵供水，供水能力满足试验流量范围的要求，通过调节闸阀的开度改变试验流量，采用电磁流量计测试流量。兼顾减小比尺效应和减少试验费用这两个方面的要求，模型进水流道的进口内径定为200mm。进水流道模型与原型保持几何相似，进水流道模型采用有机玻璃制作，进水池整体采用钢板制作，在与进水流道连接处两侧也采用透明有机玻璃制作观察窗口，以便观察和摄录流态。

2 结果与分析

2.1 羊肚菌2 种病害发病症状及规律

羊肚菌白霉病和蛛网病2 种病害发病症状见图1。

图1 病害症状Fig.1 Disease symptoms

如图1A 所示，羊肚菌白霉病病害症状为菌盖和菌柄区域性感染，菌盖发病较多，呈白色霉状，蔓延速度较快[12]。若羊肚菌幼菇被感染，白色菌丝会快速蔓延至整个子实体，导致其无法生长。白霉病发生规律为，在棚内温度高、通风不畅、高温高湿的情况下易发生。

如图1B 所示，蛛网病病害症状表现为外源营养袋周围发病较多，地面呈现大面积白色霉层，菌丝呈蜘蛛网状。从菌柄基部开始逐渐向菌盖感染，直至包裹整个子实体，其蔓延速度较快，特别是羊肚菌幼菇被感染后，菌丝会快速蔓延至整个子实体，导致羊肚菌子实体停止生长，甚至倒伏死亡。蛛网病发生规律为，在采取保温措施后棚内未及时通风或揭膜较晚而导致棚内通风不够时，以及在高温高湿的情况下容易发生。

2.2 病原菌形态鉴定

对白霉病病原菌进行分离纯化，得到病原菌菌株YDJB-02，其形态特征见图2。

图2 病原菌菌株YDJB-02 的形态特征Fig. 2 Morphological characteristics of pathogenic strain of YDJB-02

由图2 所示，菌株YDJB-02 菌落为圆形，气生菌丝白色、生长旺盛，生长速度较慢，25 ℃恒温培养箱中7～10 d 长满PDA 平板（直径60 mm）。菌丝体有膨大结构，分生孢子梗呈侧生，分生孢子为链式、顶端着生，圆形，光滑，有间隔。符合《真菌鉴定手册》[13]的拟青霉属（Paecilomyces） 描述的形态特征，所以初步鉴定分离得到的菌株为拟青霉属（Paecilomyces）。

对蛛网病病原菌进行分离纯化，得到病原菌菌株YDJB-03 其形态特征见图3。

图3 病原菌菌株YDJB-03 的形态特征Fig.3 Morphological characteristics of pathogenic strain of YDJB-03

由图3 所示，该菌株菌落为圆形，气生菌丝为絮状，生长旺盛，菌落正面为白色，背面为浅黄色，生长速度较快，25 ℃恒温培养箱中3～5 d 长满PDA平板（直径60 mm）。分生孢子梗呈帚状或轮枝状分枝，分生孢子单生或聚生，分生孢子卵圆形，无色，0～1 个隔，符合葡枝霉属（Cladobotryum) 真菌[菌寄生属（Hypomyces） 真菌的无性阶段] 的形态特征[14-15]。

2.3 病原菌系统发育分析

经过DNA 提取、扩增、测序和双向序列校对，YDJB-02 的ITS 序列与登记号为EU553300.1、KY490042.1、AY624194.1 的长毛拟青霉（P. penicillatus） 序列的相似度分别达99.42%、99.63%、100.00%。用根霉属（Rhizopus） 作为外群，构建系统发育树，见图4。

图4 基于ITS 序列的拟青霉属Paecilomyces 系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of Paecilomyces based on ITS sequence

由图4 可知，根霉属（Rhizopus） 与拟青霉属（Paecilomyces） 分为2 个大的进化枝；病原菌菌株与长毛拟青霉聚在同一支系。结合菌落形态、显微结构和分子系统学分析，将分离纯化出的病原菌YDJB-02 菌株鉴定为长毛拟青霉（P. penicillatus）。

经过DNA 提取、扩增、测序和双向序列校对，病原菌YDJB-03 的ITS 序列与已发表金黄菌寄生（Hypomyces aurantius） [无性型为异形枝葡霉（Cladobotryum varium）] MH858568.1、MH855045.1、MH864222.1 的相似度分别达99.67%、99.82%、99.47%。用拟青霉属（Paecilomyces） 作为外群，构建系统发育树，见图5。

图5 基于ITS 序列的菌寄生属Hypomyces 系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of Hypomyces based on ITS sequence

由图5 可知，菌寄生属（Hypomyces） 与拟青霉属（Paecilomyces） 分为2 个大的进化枝；病原菌菌株与金黄菌寄生聚在同一支系。结合菌落形态、显微结构和分子系统学分析，将分离纯化出的病原菌鉴定为金黄菌寄生（Hypomyces aurantius） 无性型为异形枝葡霉（Cladobotryum varium）。

3 结论与讨论

通过对羊肚菌白霉病病原菌进行分离纯化，结合形态学特征和分子鉴定结果，表明引起羊肚菌白霉病的病原菌为长毛拟青霉（P. penicillatus）。有研究人员针对羊肚菌白霉病病害进行调查和研究，通过科赫氏验证，发现其病原菌为长毛拟青霉（P.penicillatus）[16-18]。这与本试验的结果一致，这为下一步羊肚菌的病害防治奠定了基础。有研究表明枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis） 制剂和多菌灵对长毛拟青霉菌丝生长有较好的抑制效果，其中，枯草芽孢杆菌制剂为生物类药剂，不会使其菌株产生抗药性，且绿色环保。因此，在羊肚菌栽培中，如果发生白霉病，可斟酌使用枯草芽孢杆菌制剂和多菌灵。

通过对蛛网病病病原菌进行分离纯化，结合形态特征及分子鉴定，结果表明引起羊肚菌蛛网病的病原菌为异形枝葡霉（C. varium），有性型为金黄菌寄生（H. aurantius），该病原菌于1860 年在多孔菌（Polyporus varius Pers.: Fr.） 上发现并被首次报道[14]。研究表明引起蛛网病的病原菌主要为凸出枝葡霉（Cladobotryum protrusum）、异型葡枝霉（Cladobotryum varium）、嗜菌葡枝霉（Cladobotryum mycophilum） 和树状枝葡霉（Cladobotryum dendroides） 等[19-20]，且在金针菇（Flammulina filiformis）[21-22]、斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus）[23-24]、刺芹侧耳（Pleurotus eryngii var. tuoliensis）[25]等食用菌中发现引起蛛网病的病原真菌为异形枝葡霉，与本试验中引起羊肚菌蛛网病的病原菌结果一致，但异形枝葡霉引起羊肚菌蛛网病还是首次报道。本试验利用分子生物学手段对羊肚菌蛛网病病原菌进行了鉴定，明确了其病原菌为异形枝葡霉，为该病害的防治奠定了理论基础。关于羊肚菌蛛网病病原菌异形枝葡霉的生物学特性、发生特点和防控技术还有待于进一步研究。