1 株野生元蘑的鉴定、驯化栽培及孢子活性成分分析*

刘姿彤，王延锋**，马怀良，魏继承，张 鹏，张丕奇，戴肖东，马银鹏，张秀丰

（1.黑龙江省农业科学院牡丹江分院，黑龙江 牡丹江 157000；2.黑龙江省科学院微生物研究所，黑龙江 哈尔滨 150010；3.牡丹江师范学院，黑龙江 牡丹江 157000；4.黑龙江华腾生物科技有限公司，黑龙江 佳木斯 154400）

元蘑（Sarcomyxa edulis） 又称亚侧耳、冻蘑、美味扇菇、黄灵菇、黄蘑等，隶属于蘑菇目（Agaricales） 小菇科（Mycenaceae） 美味扇菇属（Sarcomayxa）[1]。元蘑细嫩清香、味道鲜美、营养丰富，富含蛋白质、多糖、氨基酸、维生素等营养物质，有强筋健骨、祛风活血等功效[2-3]。元蘑多糖有抗肿瘤、抗辐射、提高免疫力等作用，具有很高的药用价值[4]。野生元蘑种质资源十分丰富，是我国东北地区著名的野生食（药） 用菌。

元蘑人工栽培历史较短，但随着市场需求增加，产业规模也不断扩大。目前人工栽培元蘑的产量和品质均不稳定，这与菌种和栽培模式密切相关。现阶段研究多集中在栽培方面，对元蘑菌种及种质资源的报道并不多见。通过对野生元蘑菌株进行鉴定及驯化栽培，并测定其孢子的活性成分，以期为今后遗传育种工作及药用价值研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株

野生子实体于2021 年采自黑龙江省牡丹江市牡丹峰自然保护区，地理坐标为129°77′E，44°45′N，海拔520 m。采用组织分离法[5]分离菌株，菌株编号为Y19，菌种保藏于黑龙江省农业科学院牡丹江分院食用菌研究所。

1.1.2 基础培养基

马铃薯综合培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO40.5 g、MgSO40.5 g、琼脂20 g，加蒸馏水定容至1 000 mL。

1.1.3 其他试剂

Ezup 柱式真菌基因组DNA 提取试验盒、PCR 通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），由生工生物工程（上海） 股份有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 形态学鉴定

观察野生子实体形态、颜色等特征并拍照记录，参照《中国大型菌物资源图鉴》[6]进行形态学初步鉴定。

1.2.2 分子生物学鉴定

将纯化后的菌株Y19 接种于基础培养基上，于25 °C 恒温培养，将培养好的菌丝体送生工生物工程（上海） 股份有限公司进行ITS 测序，根据测序结果进行分子鉴定[7]。后将已拼接序列在NCBI 中通过BLAST 检索比较，以香菇（Lentinula edodes） 为外群，利用MEGA 5.0 软件构建系统发育树。

1.2.3 菌丝培养温度试验

将菌种接种于马铃薯综合培养基中，分别将培养皿至于10、15、20、25、30 °C 条件下培养，每个温度条件设5 次重复，观察和记录菌丝生长速度。

1.2.4 最适母种培养基试验

为探究不同培养基对母种菌丝生长的影响，试验共设计4 组培养基配方，每组配方设5 次重复。

1） 配方1：麸皮20 g（水煮后取滤液）、黄豆粉10 g、葡萄糖20 g、KH2PO41 g、MgSO41 g、琼脂20 g。

2） 配方2：马铃薯200 g（水煮后取滤液）、黄豆粉25 g、葡萄糖20 g、KH2PO42 g、MgSO41 g、VB10.1 g、琼脂20 g。

3） 配方3：木屑40 g（水煮后取滤液）、马铃薯200 g（水煮后取滤液）、葡萄糖20 g、蛋白胨0.5 g、琼脂20 g。

4） 配方4：马铃薯200 g（水煮后取滤液）、葡萄糖20 g、KH2PO41 g、MgSO41 g、琼脂20 g。

根据以上配方配制培养基后均用蒸馏水定容至1 000 mL。

1.2.5 出菇试验

1） 原种配方：木屑86%、麸皮13%、石膏1%，pH 自然，含水量55%～58%。

2） 栽培种配方：同原种配方。

3） 装袋及灭菌：选择新鲜、无霉变的原料，按栽培种配方称量原料，拌料装袋。料袋采用规格为17 cm×35 cm×0.005 cm 的聚丙烯袋，每袋装干料500 g。采用高压灭菌，125 ℃维持3 h。

4） 接种培养：待料袋冷却至30 ℃以下时接种。在无菌环境中接种后将菌包立即移入养菌室，保持室内温度为22～25 ℃，暗光培养。发现杂菌污染菌包及时挑出。

5） 出菇管理：采用棚室墙式出菇模式，出菇期温度维持在10～20 ℃，空气相对湿度为85%～90%。

1.2.6 孢子活性成分测定

根据《保健食品功效成分检测方法》（2011 版）[8]测定元蘑孢子粗多糖的含量；依据《食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5-2016）[9]测定元蘑孢子蛋白质含量；根据《保健食品理化及卫生指标检验与评价技术指导原则》（2020 版）[10]测定元蘑孢子总三萜含量；根据《食品中氨基酸的测定》（GB 5009.124-2016）[11]测定元蘑孢子氨基酸含量。

2 结果与分析

2.1 野生菌株的鉴定结果

2.1.1 野生菌株的形态特征

试验采集的野生子实体形态特征见图1，担孢子形态特征见图2。

图1 野生子实体形态Fig.1 Morphology of wild fruit body

图2 野生菌株Y19 担孢子形态（标尺：10 μm）Fig.2 Basidiospore morphology of wild strain Y19（bars: 10 μm)

由图1 可知，该菌野生子实体为层叠状丛生；无菌柄；菌盖直径6～13 cm，呈扇形，颜色为黄色且不均匀，且有黏液，边缘平滑。由图2 可知，担孢子腊肠形，光滑，大小为（4.9～5.3） μm×（2.0～2.5） μm。

2.1.2 菌丝体ITS 测序分析结果

野生菌株Y19 经ITS 序列扩增后得到1 个约700 bp 的片段。将此片段提交至GenBank后获得登录号为KY962438.1，同时进行BLAST 比对。结果显示野生菌株Y19 与元蘑Sarcomyxa edulis（MH747086.1） 的同源性达99%以上，基于ITS 序列构建的系统发育树见图3。

图3 基于ITS 序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS sequences

由图3 可知，菌株Y19 与数据库中多个元蘑菌株ITS 序列聚为1 个进化枝，结合子实体形态特征和系统发育分析结果，可以判定菌株Y19 为元蘑Sarcomyxa edulis。

2.2 菌丝培养温度试验结果

不同温度对菌丝生长速度的影响见图4 和图5。

图4 不同温度对菌丝生长速度的影响Fig.4 Effects of different temperature on mycelial growth speed

图5 接种7 天后不同温度条件下的菌丝长势Fig.5 Myelial growth at different temperatures after 7 days of inoculation

由图4 和图5 可知，菌株Y19 菌丝在10～30 ℃均能生长，但在不同温度条件下菌丝长势不同，且生长速度具有显著性差异。培养温度在10～25 ℃，菌丝生长速度随温度上升逐渐加快；25 ℃时菌丝生长速度最快，菌丝最浓密；温度高于25 ℃时，菌丝生长受到抑制，生长速度减慢。综合菌丝生长速度和长势，菌株Y19 菌丝的最适培养温度为25 ℃。

2.3 最适母种培养基试验结果

不同母种培养基对Y19 菌株菌丝生长的影响情况见表1。

表1 不同母种培养基对菌丝生长的影响Tab.1 The effect of different stock culture medium on mycelial growth

由表1 可知，菌株Y19 在不同母种培养基上菌丝生长速度有显著性差异，在配方3 中菌丝生长速度最快，达6.31 mm·d-1。在配方1 和配方3 中菌丝长势强，在配方2 和配方4 中菌丝长势一般。综合菌丝生长速度和长势，配方3 为最适母种培养基。

2.4 栽培出菇

2.4.1 菌株Y19 菌丝体形态

菌株Y19 的菌丝体形态特征详见图6。

图6 菌株Y19 菌丝体形态Fig.6 Mycelial morphology of strain Y19

由图6 可知，菌株Y19 菌丝体浓密，菌落边缘整齐，气生菌丝发达，无革质状菌落，菌落色素不明显。

2.4.2 菌株Y19 栽培出菇

元蘑菌株Y19 共制作120 个栽培袋，从接种至菌丝长满栽培袋约21 d，栽培袋长满后移至出菇棚内避光后熟培养。从接种至原基形成共150 d，菇蕾较少。子实体形态特征详见图7。

图7 人工栽培菌株Y19 的子实体形态Fig.7 Fruit body morphology of cultivated strain Y19

由图7 可知，元蘑菌株Y19 菌盖平展后中等偏大，菌盖扇形呈不均匀黄色，边缘平滑，子实体数量少，栽培子实体性状与野生元蘑基本一致，一潮菇鲜品的袋平均产量为187.76 g。

2.5 菌株Y19 孢子活性成分分析结果

菌株Y19 孢子活性成分测定结果详见表2。

表2 菌株Y19 孢子活性成分Tab.2 Active ingredient in spore of strain Y19

由表2 可知，孢子中含粗多糖8.91 g·100-1·g-1，比报道中未破壁灵芝孢子粉（粗多糖含量1.94～3.39 g·100-1·g-1）[12]高；蛋白质含量为35.0 g·100-1·g-1，比子实体中（蛋白质含量32.91 g·100-1·g-1）[13]高；总三萜含量为2.51 g·100-1·g-1，比未破壁灵芝孢子粉（总三萜含量14.24～93.12 μg·g-1）[14]高；氨基酸总量为32.4 g·100-1·g-1，比未破壁灵芝孢子粉（氨基酸总量6.07 g·100-1·g-1）[15]高。

3 结论与讨论

种质资源是食用菌育种工作的基础，是食用菌优良性状的基因库，食用菌野生种质资源的采集和鉴定是食用菌产业发展的基础性研究工作[16]。对采集到的野生子实体进行形态学和分子生物学鉴定，确定其为元蘑。通过对菌丝体进行不同温度下的培养试验，明确了元蘑菌株Y19 菌丝的最佳培养温度为25 ℃。进一步筛选出最适合元蘑菌株Y19 生长的母种培养基配方为木屑40 g（水煮后取滤液）、马铃薯200 g（水煮后取滤液）、葡萄糖20 g、蛋白胨0.5 g、琼脂20 g。人工驯化栽培的元蘑菌株Y19子实体形态与野生菌株基本一致。目前广泛使用的元蘑栽培种大多来自于野生种驯化，但主栽品种更新速度慢，退化现象严重。野生元蘑菌株Y19 的驯化成功，为下一步育种工作奠定了基础。

食用菌孢子中含有多种活性成分，如多糖、三萜、蛋白质、氨基酸等，具有抗肿瘤、抗氧化、调节免疫等作用[17]。元蘑子实体成熟时会集中散发大量孢子，对收集的孢子进行活性成分测定，结果表明元蘑菌株Y19 的子实体孢子中所含的粗多糖、总三萜和氨基酸含量均高于未破壁灵芝孢子粉，孢子中蛋白质含量也比已报道的子实体中蛋白质含量高，表明元蘑孢子具有很高的药用价值。试验结果为进一步研究元蘑孢子的药理作用机制提供了理论依据。