斑玉蕈种质资源评价及遗传多样性分析*

王 红，刘俊杰，温 浩，张 鹏，曹 君，肖 军**，黄竹青

（1.辽宁省农业科学院，辽宁 沈阳 110161；2.辽宁省农业发展服务中心，辽宁 沈阳 110161；3.沈阳恒生生物科技发展有限公司，辽宁 沈阳 110161）

斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus），又名真姬菇、玉蕈等，隶属于担子菌亚门（Basidiomycotina） 层菌纲（Hymenomycetes） 伞菌目（Agaricales） 离褶伞科（Lyophyllaceae） 玉蕈属（Hypsizigus）[1]。斑玉蕈是一种低脂、高蛋白、味道鲜美的食用菌，深受广大消费者的青睐，在日本有“香在松茸，味在玉蕈”之说[2-3]。随着消费市场的不断扩大，斑玉蕈已成为仅次于金针菇（Flammulina velutipes）、杏鲍菇（Pleurotus eryngii） 的第三大工厂化品种[4-5]。其商品根据子实体颜色的不同，可分为褐色品系和白色品系，褐色品系商品名为“蟹味菇”，菌盖表面成褐色并伴有大理石状斑纹；白色品系根据菌柄长短的不同，商品名分为“白玉菇”和“海鲜菇”2 个类别，其形态差异主要是由于培养时CO2浓度不同导致[6]。

种质资源又称为遗传资源，是选育优良菌种的基础材料。种质资源的收集、评价、保藏是遗传育种研究及培育新品种的基础，对食用菌生产和科研工作有重大意义。目前，斑玉蕈种质资源评价主要采用体细胞不亲和性（拮抗反应）、分子标记、形态学特征等方法。张宏美[7]运用不同的分子标记方法对斑玉蕈种质资源进行了评价，并开展了杂交育种研究。邱成书等[8]采用ITS（internal transcribed spacer, ITS）、ISSR（inter-simple sequence repeat, ISSR）、SRAP （sequence-related amplified polymorphism,SRAP） 等方法对斑玉蕈遗传多样性进行了评价，建立了评价体系。梁锡燊[9]采用ISSR，RAPD 和SRAP分子标记法对斑玉蕈杂交菌株进行遗传多样性分析。

目前，斑玉蕈品种多从国外引进[10]，斑玉蕈栽培企业存在菌种“卡脖子”现象，而部分菌株生产企业将获得的斑玉蕈菌株又重新命名，造成市场所销售的斑玉蕈菌株命名混乱，给其种质资源的研究造成了一定困扰。因此，通过采用拮抗反应、ITS、ISSR 评价方法，将所收集的斑玉蕈种质资源从体细胞亲和性和分子标记角度进行分析，旨在确定斑玉蕈种质资源的亲缘关系，从中寻找子实体形态、栽培适应性等方面的关联信息，进而为斑玉蕈菌株新品种选育奠定种质资源的理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

于2020 年至2022 年收集供试菌株，共获得国内主要栽培的斑玉蕈菌株67 株，编号及来源见表1。

表1 供试斑玉蕈菌株Tab.1 Test strains of Hypsizygus marmoreus

如表1 所示，若斑玉蕈菌株收集形式为子实体，需要在PDA 培养基上进行组织分离获得菌丝，与试管种一起活化。活化时将67 株斑玉蕈菌丝块分别转接至PDA 培养皿中，每个菌株转接5 皿，23 ℃倒置培养12～15 d。当菌丝长到距培养皿边缘0.5 cm 时，从中选取1 个生长速度适中的培养皿，进行第2 次转接，待菌丝长满即完成活化。所有菌株均保存于辽宁省食用菌种质资源库。

1.2 试验仪器与试剂

PDA 培养基，英国OXOID 公司；真菌菌丝DNA 提取试剂盒，安诺伦北京生物科技有限公司；琼脂糖，西班牙Biowest 公司；PCR 反应相关试剂，天根生化科技有限公司。

SPX-250B-Z 恒温培养箱，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；30K30 离心机，德国Sigma 公司；TC-EA 型PCR 仪，杭州博日科技有限公司；JY-TD331A 凝胶电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 拮抗反应试验

将活化后的67 株斑玉蕈菌株，用直径为5 mm的打孔器在菌落边缘打孔，取菌块放入直径为9 cm的培养皿内对峙培养，按照农业行业标准《食用菌菌种区别性鉴定拮抗反应》（NY/T 1845-2010）[11]进行试验操作，记录菌株间的拮抗线形态。

1.3.2 DNA 提取

将收集到的斑玉蕈菌丝放入1.5 mL 离心管中，采用真菌菌丝提取试剂盒提取菌丝体总DNA，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，分装后于-20 ℃保存备用。

1.3.3 ITS 序列扩增

ITS 序列扩增引物为ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[12]。反应体系为2×Easy Taq Mix 10 μL，引物（10 μmol·L-1） 各1 μL，DNA 模板0.8 μL，ddH2O 补至20 μL。扩增反应程序为95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30 个循环；72 ℃延伸7 min[13]。PCR 产物用1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测，后送至北京六合华大基因科技有限公司测序。

1.3.4 ISSR 序列分析

查阅相关文献[8-9]，随机选取3 个样本，将文献中报道的与斑玉蕈相关的ISSR 引物进行初筛，从中选用了11 条条带丰度较高的ISSR 引物，用于多肽片段的扩增，见表2。

表2 ISSR-PCR 引物序列Tab.2 The primer sequence of ISSR-PCR

采用表2 引物，PCR 反应体系为1× Easy Taq Mix 7.5 μL，引物（10 μmol·L-1） 0.6 μL，ddH2O 补至15 μL。扩增反应程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，38 个循环；72 ℃延伸10 min。PCR 产物用2.0%琼脂糖凝胶，80 V 电压下电泳90 min 后用凝胶成像仪记录[13]。

1.3.5 数据分析

1） ITS 序列对比分析。将测序序列经MEGA 7.0 软件多序列比对后，与NCBI 数据库比对，以荷叶离褶伞（Lyophyllum decastes） 为外类群，构建基因ITS-PCR 序列的系统进化树。计算67 株斑玉蕈菌株的种间遗传距离。

2） ISSR 序列对比分析。统计67 株斑玉蕈菌株间的多态性条带数据，并用0 或1 记录。采用NTSYS pc 2.1 软件，按UPGMA 方法进行聚类分析，构建ISSR 聚类分析图。

采用PopGene 32 软件分析67 株斑玉蕈菌株种间遗传距离和相似系数，并分析等位基因（Na）、有效等位基因数（Ne）、Nei's 基因多样性指数（He）和Shannon 信息指数。

2 结果与分析

2.1 拮抗反应

67 株斑玉蕈菌株间拮抗反应明显的有2 005 组，占90.68%；无拮抗反应的有206 组，占9.32%。根据有无拮抗反应将67 个样品分为15 组，白色品系和褐色品系间均有拮抗反应，具体情况见表3 和图1。

图1 部分拮抗反应对峙图Fig.1 Partial confrontation diagram of antagonism

表3 基于拮抗反应对菌株的分组Tab.3 The strain grouping based on antagonistic reaction results

由表3 和图1 可知，第1 组11 个菌株、第4 组9 个菌株、第5 组13 个菌株、第9 组6 个菌株、第12 组2 个菌株为白色品系，菌株间无拮抗反应，与其他菌株间有明显的拮抗反应，表明各组中菌株间亲缘关系较近； 第2 组7 个菌株、第3 组6 个菌株、第6 组3 个菌株、第8 组2 个菌株、第10 组3个菌株为褐色品系，菌株间无拮抗反应，与其他菌株间有明显的拮抗反应，表明各组中菌株间亲缘关系较近。拮抗结果可将67 株斑玉蕈菌株分成15 个不同组，其中白色系菌株组8 个，褐色系菌株组7 个。

2.2 rDNA-ITS 序列对比分析

67 株供试菌株的rDNA-ITS 扩增条带在800～900 bp，双向测通后，将核酸序列在NCBI 数据库中进行比对分析。结果表明，67 个菌株的ITS 序列与GeneBank 数据库中斑玉蕈菌株的ITS 序列相似性达到99.5%以上，确定67 株供试菌株均为斑玉蕈菌株。

以荷叶离褶伞为外群，随机选取NCBI 中的9 个斑玉蕈序列，与67 株斑玉蕈菌株ITS 序列构建NJ系统进化树，见图2。

图2 基于67 个斑玉蕈菌株ITS 序列构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of 67 Hypsizygus marmoreus strains based on ITS sequences

由图2 可知，使用MEGA 7.0 软件构建系统进化树显示，67 株斑玉蕈菌株可分为3 个类群。其中组号为2、4、6、7、9、10、11、12、14 共9 个组34株菌株为类群I，组号为3、5、8、13、15 共5 个组30 株菌株为类群II，第15 组1 个菌株为类群III。第1 组中有3 株菌株聚在类群I 中，8 个株菌株聚在类群II 中，其菌株分布于ITS 系统发育树的中间区域。67 株斑玉蕈菌株种内遗传距离在0～0.079 4，平均遗传距离为0.005 5±0.001 6。

2.3 ISSR 序列分析

选用11 条具有多态性的ISSR 引物，扩增出51个条带，扩增条带的DNA 片段为300～1 500 bp，多态性比例达到90.20%，ISSR 聚类分析图见图3。

图3 ISSR 聚类分析图Fig.3 Cluster analysis plots of ISSR

由图3 的UPGMA 聚类分析发现，斑玉蕈菌株间遗传相似系数变化范围为0.70～1.00，在相似水平为0.74 时，67 个菌株分为三大类群。当相似水平为0.81 时，将类群I 分为6 个亚类群，第i 组9 个菌株、第iv 组11 个菌株、第v 组17 个菌株分别聚在一起，子实体颜色为白色；第ii 组8 个菌株、第iii组7 个菌株聚在一起，子实体颜色为褐色；第vi 组5 个菌株聚在一起，子实体颜色以褐色为主。在类群II、类群III 中，子实体颜色均为褐色。

利用PopGene 32 软件对67 株斑玉蕈菌株的ISSR 结果进行统计分析，遗传分析结果表明，斑玉蕈种质的平均等位基因（Na） 为1.920 5±0.272 1，平均有效等位基因数（Ne） 为1.461 5±0.344 1，平均Nei's 基因多样性指数（He） 为0.276 5±0.171 5，平均Shannon 信息指数（I） 为0.422 6±0.227 9。遗传距离和相似系数分析结果表明，67 株斑玉蕈菌株间Nei's 遗传距离为0.034 7～0.627 2，遗传相似系数为0.500 0～1.000 0，表明67 株斑玉蕈菌株种质遗传多样性水平较高。

3 结论与讨论

斑玉蕈的栽培起源于日本，1972 年日本宝酒造株式会社首次人工栽培成功[1]。20 世纪80 年代起，我国对斑玉蕈开始进行生物学特征及栽培条件研究，目前已成为仅次于金针菇、杏鲍菇的又一工厂化栽培菌种。随着栽培产业的快速发展，斑玉蕈菌种生产中存在同名异物或同种异名的现象，一直均未得到有效的解决。因此，建立一套快速有效的菌种评价方法，对斑玉蕈菌种的鉴定十分必要。本研究对国内主要的斑玉蕈种质资源进行了拮抗试验，结果表明，67 株斑玉蕈菌株可确定为15 个不同组，表明不同菌种生产及栽培企业存在使用相同菌种的情况。

3.1 拮抗反应在斑玉蕈菌株评价中的作用

微生物间的拮抗反应在自然界中普遍存在，为防止遗传中不同个体间的融合，是一种种间排除异己的现象[14]。真菌间的拮抗反应主要表现为不同菌落相互接触后，出现拮抗线。不同菌株拮抗线的颜色、宽度等特征差异较大，而相同菌种间无此现象[15-16]。试验中不同斑玉蕈菌株进行拮抗反应时，符合真菌间拮抗反应的特性。斑玉蕈菌株间的拮抗反应属于隆起型，相同菌株间的菌落交界处菌丝隆起，但从背面观察，培养基中无带状色素沉淀产生；不同菌株间菌落交界处菌丝隆起，随着隆起时间的延长，菌落交界处培养基中有带状色素沉淀产生，即拮抗线，且拮抗线颜色、宽窄不一，从拮抗线的形态也能反映出不同菌株间亲缘关系的远近，这与黑木耳（Auricularia heimuer）种间发生拮抗反应后拮抗线产生颜色的现象类似[17]。从菌株子实体颜色看，白色品系和褐色品系菌株间均会产生明显的拮抗反应，与金针菇白色菌株和黄色菌株间产生明显拮抗线的表现一致[18]。2个品系间不但有拮抗反应，而且营养成分含量也不同[19-20]，因此评价种质资源时同时关注对应的子实体颜色有一定的实际意义。

3.2 rDNA-ITS 序列对比分析在斑玉蕈菌株评价中的作用

ITS 序列是内转录间隔区（internally transcribed spacer，ITS），位于真菌18S、5.8S 和28S rRNA 基因之间，具有较高的保守性。ITS 的保守性表现为种内相对一致，种间差异明显，因此被广泛用于真菌不同种属的鉴定、种内遗传多样性分析[21-22]。供试样本ITS 序列对比后均被鉴定为斑玉蕈，67 株斑玉蕈菌株间亲缘关系近，遗传距离小，分化程度低，与林辉等[12]对19 株斑玉蕈进行ITS 聚类分析的结果相似。通过系统进化树将67 株供试菌株分为3 个类群，从菌株的子实体颜色看，ITS 序列分析无法区分子实体颜色；从菌株来源看，从大型工厂化瓶栽斑玉蕈的子实体中分离得到的菌株，绝大部分聚在类群II，可推测聚类于类群II 的菌株更适合用于工厂化瓶栽出菇。

3.3 ISSR 序列分析在斑玉蕈菌株评价中的作用

ISSR 是一种简单重复序列间的扩增多态性分子标记，可同时提供多位点信息，并揭示不同SSR 位点个体间的变异信息[23]。通过UPGMA 聚类分析发现，在相似水平为0.74 时，67 株斑玉蕈分为三大类群。当类群I 中的相似水平为0.81 时，分为6 个聚类群。这6 个聚类群和类群II、III 可将子实体的颜色基本区分开。只有类群I 中的第6 个聚类群中含有褐色子实体和白色子实体， Z10、Z28、Z32 和Z45 间无拮抗反应，子实体颜色为褐色；Z15 子实体颜色为白色。一般情况下，白色品系是褐色品系的白色突变种[24]，Z15 和Z10、Z28、Z32、Z45 聚为一类，表明5 个菌株间具有较多共同的遗传背景[25]，Z15 有可能是Z10 的突变株，但还需通过转录单位间隔区2（IGS2）、随机扩增多态性DNA（RAPD）等分子标记技术进一步验证[26]。

3.4 不同评价方法的比较

斑玉蕈种质资源评价采用了拮抗反应、ITS 和ISSR 共3 种评价方法，3 种评价方法相辅相成，各有优缺点。拮抗反应操作简单，通过菌株菌落交界处菌丝的形态，即可判断出对峙菌株间有无拮抗反应，对于菌株种属信息明确的菌株，采用这种判断方法便捷可靠；但当菌株种属信息不全时，还需有ITS 的辅助证明才能确定。ITS 评价方法可有效判断菌株的种属信息，还可以初步判断菌株种间的遗传距离，但精确度低于ISSR 分析。ISSR 分析精确度较高，但需要样本量较大，如拮抗反应试验的第1组中，组内菌株间无拮抗反应，但通过ISSR 分析发现部分菌株分布于不同的类群中；而与所有菌株都有拮抗反应的菌株（如Z15），由于样本数量有限，缺乏与之无拮抗反应的菌株，因此ISSR 聚类的有效性需要其他的分子标记方法辅助验证。

通过试验评价了所收集到的斑玉蕈种质资源，3 种评价方法提供了多种有价值的信息，由于单一评价方法在理论上或实际应用中有其优势和局限性，将3 种评价方法相结合可弥补单一评价方法可能存在的误差。种质资源评价的实践意义在于生产实践，通过对斑玉蕈进行种质资源评价，得知适宜工厂化栽培的菌株主要分布于ITS 法聚类的第II 类群，ISSR 法聚类中第I 大类群中的i、ii 类群及第III 大类群，且ISSR 法可将子实体颜色进行区分。试验以3 种评价方法得出的结论，可为斑玉蕈新品种选育、颜色遗传规律研究提供初步遗传背景信息。