1 株野生斑玉蕈的生物学特性及驯化栽培*

吕 童，罗红梅，苏开美，何 俊，唐松明，李树红**

（1.云南大学资源植物研究院，云南 昆明 650500；2.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，云南 昆明 650205）

斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus） 隶属于担子菌门（Basidiomycota） 伞菌纲（Agaricomycetes） 伞菌目（Agaricales） 离褶伞科（Lyophyllaceae） 玉蕈属（Hypsizygus），野生资源主要分布于中国的云南、东北，以及日本、西伯利亚、欧洲、北美洲等地区，秋季多发生于壳斗科植物的枯木和倒木上[1-2]。

斑玉蕈因具有鲜厚嫩滑的口感为人称道，近年研究表明斑玉蕈具有提高动物抗病性、抗疲劳以及抗癌的作用[3-6]。栽培斑玉蕈自1986 年引入中国以来，很快就在食用菌市场上大放异彩，现已成为我国继金针菇（Flammulina filiformis） 与杏鲍菇（Pleurotus eryngii） 后的全国第三大食用菌工厂化栽培品种[7]。目前福建、广东、山东、湖南、上海等省（市） 均实现了斑玉蕈工厂化栽培，截止到2020 年，斑玉蕈年产值达到416 244.63 万元。

研究发现，斑玉蕈对生存环境的要求较高，多生于未被破坏的原始森林中，由于环境变化，现存的斑玉蕈野生种群极为稀少[1]。国内外有关野生斑玉蕈资源开发利用的报道较少，斑玉蕈新品种选育主要利用现有的商品种进行诱变和杂交[8-9]。为了适应行业的发展，亟需新的种质资源以选育出具有自主知识产权、可进行工厂化栽培的斑玉蕈品种。我国斑玉蕈人工栽培技术较成熟，在菌种保藏、不同栽培料对斑玉蕈生长的影响、不同品种营养成分对比等方面均取得了一定的成果，但斑玉蕈优质种源获取和品种选育方面仍是短板[10-17]。试验以采自西藏的野生子实体为材料，对其进行形态和分子鉴定，开展菌株生物学特性研究，并进行驯化栽培。旨在为实现选育出具有自主知识产权的斑玉蕈新品种和工厂化栽培奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

野生菌株子实体由李树红研究员于2018 年8 月25 日采集自西藏自治区林芝市（海拔3 890 m，97°58′9″ E，28°35′32″ N），该子实体生于湿润、潮湿的腐木上。通过组织分离获得菌株L4550，保存于云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所种质资源库。

1.2 供试培养基

PDA 母种培养基配方：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、酵母粉2 g、硫酸镁0.2 g、磷酸二氢钾0.2 g、琼脂粉16 g，水1 L，pH 自然。

试验基础培养基配方：葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、硫酸镁0.2 g、琼脂粉16 g，水1 L，pH 自然。

原种栽培料配方：木屑40%、玉米芯20%、米糠20%、麸皮15%、玉米粉4%、氢氧化钙1%。根据原种栽培料配方质量比称取各种原材料，将木屑、玉米芯提前用水浸泡12 h，然后加水拌匀，最终含水量为60%～70%。将栽培料装入体积为1 100 mL的栽培瓶，每瓶装料555～560 g。

1.3 形态鉴定

参照李博等[18]的方法，对野外采集的标本进行拍摄，拍摄时应将子实体的菌盖、菌褶、菌柄拍摄清晰。新鲜标本通过组织分离获得菌株后，在40～60 ℃烘箱内烘烤获得干标本，编号并保存。同时采用徒手切片法制作切片，用刚果红染色后，在显微镜下观察子实体菌盖、菌柄、菌褶的显微结构。

1.4 分子鉴定

取L4550 菌株的纯培养菌丝50 mg 或干标本20 mg 置于研钵中，加入液氮用研杵对组织样本进行研磨，随后用北京金沙生物科技有限公司高效植物基因组DNA 提取试剂盒提取DNA。选用通用引物ITS4、ITS5 进行PCR 扩增，PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，点样量为3 μL，电泳电压为160 V、电流80 mA、电泳时间20 min。电泳后用紫外线凝胶成像仪观察、拍照并记录结果，产物送生工生物工程（上海） 股份有限公司进行测序。

测序结果经过MAFFT 对齐和BioEdit 手动调整后，以荷叶离褶伞（Lyophyllum decastes） 为外类群，使用软件RAxML-HPC2 on XSEDE（8.2.12） 以最大似然法构建系统发育树。除试验获得的序列外，其余序列均来自GenBank。

1.5 生物学特性分析

将L4550 菌株接种于PDA 培养基中活化，待菌丝长满平板，用打孔器（直径0.5 cm） 取边缘菌丝接种于试验培养基中央，除温度试验外，其余试验平板均置于22 ℃的恒温培养箱中，每个试验设置6组重复。每2 天测量一次菌落直径，观察并记录菌丝生长速度及菌丝疏密度。数据结果采用Excel 2021 和SPSS 27.0 进行统计分析。

1.5.1 单因素试验

1） 碳源试验。以不加碳源的基础培养基为空白对照（CK1），试验组分别加入葡萄糖、麦芽浸粉、蔗糖、果糖、乳糖，形成6 个不同的碳源处理组。

2） 氮源试验。以不加氮源的基础培养基为空白对照（CK2），试验组分别加入蛋白胨、黄豆粉、尿素、酵母粉、硝酸钾，形成6 个不同的氮源处理组。

3） 无机盐试验。以不加无机盐的基础培养基为空白对照（CK3），试验组分别加入硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、氯化钙、碳酸钙，形成6 个不同的无机盐处理组。

4） 生长因子试验。以不加生长因子的基础培养基作为空白对照（CK4），试验组分别添加0.01 g 的复合维生素B、维生素C、维生素E、吲哚乙酸、肌醇，形成6 个不同的生长因子处理组。

5） 温度试验。在基础培养基中接入菌种，将接种后的平板置于6 个不同温度条件下培养，温度分别设置为：16、18、20、22、24、26 ℃。

6） pH 试验。用HCL 溶液（1 mol·L-1）和NaOH溶液（1 mol·L-1） 调节基础培养基pH，使其初始pH 分别为自然、5、6、7、8、9。将菌种接种于6个初始pH 不同的基础培养基中培养。

1.5.2 正交试验

根据单因素试验结果，在6 组单因素试验中，选择对菌丝生长影响较大的4 个因素，在每个因素中挑选较优的3 个水平，设计因素水平表。

1.6 驯化栽培

1.6.1 母种制备

将保存的L4550 菌株活化，接种于PDA 培养基中，置于22 ℃恒温培养箱中暗培养备用。

1.6.2 原种制备

原种栽培料于121 ℃灭菌2 h，冷却后将母种按照1 ∶6（V/V） 的比例接种，接种后置于22 ℃的培养室内暗培养。

1.6.3 栽培种制备

按照原种栽培料配方配制栽培料，灭菌冷却后，将原种按照1 ∶20（V/V） 的比例接种，接种后置于培养室内暗培养。

1.6.4 出菇瓶制备

按照原种栽培料配方配制栽培料，拌料装瓶，灭菌冷却后，将栽培种按1 ∶20（V/V） 的比例接入栽培瓶中，标明菌种号以及接种日期，置于培养室暗培养。

1.6.5 出菇试验

待菌丝长满栽培瓶且后熟1 周后，根据刘明广等[19]的出菇管理方法进行搔菌处理，轻轻刮去栽培料表面的老菌皮，将栽培瓶置于温度为14 ℃、空气湿度为90%的人工气候箱内，给予一定光照并通风，刺激原基分化，待子实体成熟后采摘。

1.7 营养成分分析

根据《食品安全国家标准食品中水分的测定》（GB 5009.3-2016）[20]、《食品安全国家标准食品中灰分的测定》（GB 5009.4-2016）[21]、《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》（GB 5009.6-2016）[22]、《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5-2016）[23]、《食品安全国家标准食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》（GB 5009.8-2016）[24]、《食品安全国家标准食品中膳食纤维的测定》（GB 5009.88-2014）[25]、《食用菌中粗多糖含量的测定》（NY/T 1676-2008）[26]、《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》（GB 5009.124-2016）[27]、《食品安全国家标准食品中多元素的测定》（GB 5009.268-2016）[28]等标准，对采收和市场上购买的斑玉蕈子实体进行营养成分检测，并对比测定结果。

2 结果与分析

2.1 形态特征

斑玉蕈L4550 的形态结构特征详见图1。

图1 斑玉蕈L4550 的形态特征Fig.1 Morphological characteristics of Hypsizygus marmoreus L4550

如图1 所示，斑玉蕈L4550 子实体中型；菌盖圆形，中间微凹，表面光滑无绒毛，橄榄棕色，直径为2.95～6.74 cm；菌肉白色，厚0.37～0.51 cm；菌褶白色，宽0.31～0.32 mm，较密，直生，不等长，边缘光滑；菌柄白色至淡褐色，圆柱形，中生，表面光滑，长9.93～14.79 cm，直径0.62～1.29 cm；孢子印白色。其显微结构见图2。

图2 斑玉蕈L4550 的显微结构图Fig.2 Microstructure diagram of Hypsizygus marmoreus L4550

由图2 显微结构可知，菌盖表皮细胞丝状，薄壁，呈盘错交织状，细胞大小为（30.1～115.1） μm×（2.4 ～4.6） μm。担子大小为（18.7 ～32.0） μm ×（5.2～7.5） μm，平均为22.2 μm×6.6 μm，薄壁，透明；每个担子上有2 或4 个担子梗，担子梗长为1.6～3.5 μm，基部宽为0.8～1.6 μm。孢子球形或卵形，大小为[（3.1）3.3～5.0（5.7）] μm×[（2.7）3.0～4.7（4.9）] μm，平均大小为4.2 μm×3.8 μm，Q 值为0.9～1.6。不孕担子呈棒状，薄壁，透明，大小为（13.7～30.4） μm×（1.7～5.5） μm。菌柄细胞呈丝状，薄壁，透明，大小为（22.1～166.2） μm×（2.7～7.0）μm。锁状联合在菌盖、菌柄和菌褶中较为常见。试验标本与上官舟建[29]、林汝楷等[30]对斑玉蕈的描述相似。

2.2 分子鉴定结果

用于进行系统发育分析的序列信息见表1，所构建的系统发育树见图3。

表1 试验中用于系统发育分析的序列清单Tab.1 List of sequences used for phylogenetic analysis in trials

图3 基于ITS 序列构建的玉蕈属系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of Hypsizygus based on ITS sequence

由图3 可知，L4550 菌株与Hypsizygus marmoreus OP980886 最接近，序列相似率为99.41%，且2 条序列以100%的支持率聚为一支。另外2 株斑玉蕈Hypsizygus marmoreus MG735351、Hypsizygus marmoreus HQ436116 与L4550 菌株（Hypsizygus marmoreus OQ560339） 也在同一个系统发育分支中，且L4550 与2 个已知斑玉蕈菌株碱基差异率为1%。结合形态学鉴定结果，支持该菌株为斑玉蕈Hypsizygus marmoreus。

2.3 生物学特性试验结果

2.3.1 单因素试验结果

菌丝生长的单因素试验结果详见图4 和图5，图中菌丝生长速度均为6 次重复的平均值。

图4 不同因素对斑玉蕈菌丝生长的影响Fig.4 Effect of different factors on mycelial growth of Hypsizygus marmoreus

图5 不同条件下L4550 菌株菌丝生长情况Fig.5 Mycelial growth of strain L4550 under different conditions

由图4 和图5 可知，L4550 在5 种碳源上皆可生长，结合生长速度及菌丝长势，最优碳源为麦芽浸粉，最差为乳糖。L4550 菌丝在含蛋白胨、黄豆粉、酵母粉的培养基中长势较好，菌丝洁白浓密；其中在酵母粉培养基中菌丝长势最快，且与其他处理组差异显著；在尿素培养基中菌丝生长最缓慢，且菌丝稀疏。L4550 菌丝对无机盐适应性较强，除碳酸钙外，菌丝对试验所用其他无机盐反应差异不显著。与空白对照（CK4） 相比，复合维生素B、维生素C、维生素E、吲哚乙酸、肌醇对L4550 菌丝生长速度及长势促进作用不明显。L4550 在不同的温度条件下菌丝生长有差异，当温度≤24 ℃时，菌丝生长速度随温度升高而加快；当温度达26 ℃时，菌丝生长速度减缓。斑玉蕈菌丝在pH 为5～9 的环境条件下皆可生长，其中菌丝生长最快时培养基pH 为9。

2.3.2 正交试验结果

根据单因素试验结果，选择对L4550 菌株影响较大的碳源（麦芽浸粉、蔗糖、果糖）、氮源（酵母粉、黄豆粉、蛋白胨）、温度（24 ℃、26 ℃、22 ℃）、pH（9、8、自然） 4 个因素进行四因素三水平的正交试验，正交试验表及结果详见表2、表3、表4 和图6。

表2 因素水平表Tab.2 Table of factors and levels

表3 斑玉蕈菌株L4550 正交表及结果Tab.3 Orthogonal and results table of Hypsizygus marmoreus L4550

表4 正交试验结果方差分析Tab.4 Analysis of variance of orthogonal test results

图6 正交试验中L4550 菌株菌丝生长情况Fig.6 Mycelial growth of strain L4550 in orthogonal test

如表3、表4 和图6 所示，正交试验结果差异显著，L4550 菌株菌丝在处理4 的培养基上生长速度最快，且菌丝洁白浓密。因此，L4550 菌株的最佳培养基配方为酵母粉2 g、蔗糖20 g、磷酸二氢钾0.2 g，琼脂粉16 g，水1 L，pH 自然，培养温度为26 ℃。

2.3.3 驯化出菇试验结果

L4550 菌株在母种培养阶段，菌丝洁白浓密，边缘整齐，气生菌丝强，10～12 d 长满平板。在以木屑为主的栽培基质中，菌丝呈绒毛状，生长浓密，22 ℃条件下60～62 d 长满瓶。驯化出菇试验结果详见图7。

图7 斑玉蕈菌株L4550 出菇情况Fig.7 Fruiting situation of strain L4550

由图7 可知，当出菇温度为14 ℃，空气湿度为90%时，斑玉蕈原基数量较大，呈白色针头状。随着原基的生长，其菌盖逐渐分化，由白色转变成灰棕色，20～22 d 后即可采收子实体。该菌株子实体丛生；菌盖棕色，幼时菌盖表面有明显的大理石斑纹，成熟后大理石斑纹变淡；菌柄灰白色，表面覆有细绒毛。人工栽培的斑玉蕈子实体与野生子实体存在一定差异，与商品斑玉蕈（LT002） 相比，试验驯化的斑玉蕈子实体菌柄颜色偏白；菌盖中央斑纹密集，边缘斑纹不明显；烘干后子实体海鲜味浓郁，一般可采二潮菇。

2.4 营养成分分析结果

将L4550 菌株子实体中的营养成分与市场上购买的斑玉蕈（LT002）进行对比，结果详见表5。

表5 营养成分对比数据表Tab. 5 Comparison data of nutritional components

由表5 可知，L4550 菌株子实体中的灰分、蛋白质、膳食纤维、食用菌多糖含量明显高于购买斑玉蕈，而脂肪的含量较低。在氨基酸组成成分中，L4550 各氨基酸含量均明显高于LT002，其中鲜味氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸） 和苦味氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸） 含量明显高于LT002。在无机盐成分中，L4550 的钾、镁、铁、锌、锰的含量高于LT002，尤其是钾离子含量是购买的近2 倍；且L4550 中重金属砷、汞、镉含量均低于《食品安全国家标准食品中污染物限量》（GB 2762—2017）[31]要求（镉限量0.2 mg·kg-1、总汞限量0.2 mg·kg-1、总砷限量0.2 mg·kg-1）。

3 结论与讨论

优良的种质资源对斑玉蕈工厂化发展至关重要，试验通过对采集到的野生斑玉蕈L4550 菌株进行生物学特性及驯化栽培试验，以发掘其利用潜能。在生物学特性试验中，L4550 菌株对碳源适应性较广，总体来看，多糖（麦芽糖、蔗糖） 的表现优于单糖（葡萄糖、果糖）。一般而言，食用菌对单糖的利用率高于双糖和多糖，但试验结果与这一结论相反。付卓识[32]认为这可能是培养基经过高温灭菌后，pH发生变化导致斑玉蕈菌丝对糖的摄取方式发生转变。在氮源试验中，添加有机氮（蛋白胨、酵母粉、黄豆粉） 的培养基中菌丝生长较优，这与颜松[33]和图力古尔等[1]的研究结果相似。以尿素和硝酸钾为氮源的试验中，菌丝生长较差。付卓识[32]和郭向华等[34]认为，尿素在高压灭菌时会释放大量氨味气体，导致斑玉蕈菌丝生长异常。该菌株对无机盐的利用情况差异较小，最适无机盐条件有待进一步筛选。L4550 菌株对生长因子的适应性差别较小，原因可能是所用的生长因子对L4550 菌株作用不大，也可能是所用的生长因子浓度太低，导致其作用效果不明显，具体原因有待进一步探索。斑玉蕈属于低温变温型食用菌，其对温度的反应与付卓识等[32]的研究结果相似。高压灭菌会使培养基的pH 下降，pH试验显示初始pH 为9 时，L4550 菌株菌丝生长最快，故L4550 菌丝在中性或偏碱性的培养基中生长状态较好。

试验通过人工驯化实现了野生斑玉蕈L4550 菌株在非自然条件下出菇，在出菇过程中该菌株表现出了菌丝活性强、原基分化量大、出菇早等优点，但同时也存在出菇不整齐的缺点。根据食品安全国家标准的方法，对L4550 菌株子实体进行营养成分测定，结果表明斑玉蕈L4550 是一种营养价值高且低脂的健康食品。故认为试验所驯化的斑玉蕈菌株具有较好的栽培研究价值，可作为选育斑玉蕈新品种的优良材料。