槐角中染料木苷和槐角苷的匀浆-超声协同提取工艺的研究

范昌文 ,李欣 ,徐明 ,杨磊* ,付卓锐 ,莫开林*

1.东北林业大学化学化工与资源利用学院,黑龙江 哈尔滨 150040；

2.凉山州林业调查规划设计院,四川 西昌 615000；

3.四川省林业科学研究院,四川 成都 610081

槐角是豆科乔木植物槐（Styphnolobium japonicum）的荚果，成熟后经过炮制可入药，具有清热凉血之功效，常用于肠热便血，眩晕目赤等症状，因此被收录于2020 年版本的《中国药典》[1]。化学成分研究表明槐角中含有丰富的异黄酮类物质，如染料木苷和槐角苷等[2]，异黄酮被人们认为是植物雌激素，具有预防骨质疏松和心脑血管病变，抗癌等功效[3]。在已有的研究报道中，异黄酮类物质提取的方法有回流提取法、亚临界水提取法、加压溶剂提取等方法[4,5]，但都存在提取效率低、反应时间长、操作成本高等缺点。因此，寻找高效的具有工业化前景的提取槐角中的染料木苷与槐角苷的工艺研究势在必行。

匀浆是通过高速运转的刀片和流体切割的作用，在匀浆装置中将物料与提取溶剂混合，将物料粉碎。匀浆还有助于将样品与萃取溶剂彻底混合，因此萃取溶剂可以更好地渗透到样品中，让物料的破碎与提取同步进行，强化提取效率。该方法以往经常用于在动物组织中提取蛋白质[6]、氨基酸[7]等成分，由于它操作简单，还省去了粉碎的步骤，同时还能避免粉尘的出现，因此对于植物材料的提取也有很大的适用价值[8]。作为一种常用的提取方法，超声辅助提取的优点是提取效率高，而且易于工业放大。超声波产生的振动效应和空化效应，使异黄酮等胞内物质释放、溶解和扩散速度加快，从而使提取效率明显提高[9-12]。尝试采用匀浆-超声协同提取法从槐角中同时提取染料木苷与槐角苷，为槐角进一步的开发利用提供一定的技术基础。

1 材料与仪器

槐角购于大西北药业有限责任公司，室温下避光储存在密闭玻璃干燥器内，所有用到的槐角原料均来自同一批次。对照品染料木苷（纯度≥98%）、槐角苷（纯度≥98%）从阿拉丁（中国上海）生化科技股份有限公司购入，色谱级甲醇和磷酸从塞莫非世尔科技（中国）有限公司购入，乙醇从天力（中国天津）化学试剂有限公司购入。1260 高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；JY92-IID 超声波细胞破碎仪，上海熙扬仪器有限公司；多功能破壁机，中山市今彩电器厂。

2 实验方法

2.1 高效液相色谱定量测定的条件

染料木苷和槐角苷分别采用高效液相色谱法测定，仪器为安捷伦Agilent1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），安捷伦色谱柱，型号为Agilent 5 TCC18，填料粒径5 μm，柱长度250 mm，直径4.6 mm，色谱条件：流动相比例为甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液，洗脱梯度为：0—2 min，10%A；2—13 min，10%A—60%A；13—15 min，60%A—85%A；15—20 min，85%A；20—21 min，85%A—10%A；21—25 min，10%A。洗脱流速是1.0 mL·min-1，进样量为10 μL，检测波长是262 nm，柱温是30 ℃，检测总运行时间是25 min。

2.2 标准曲线的确定

分别配置0.1，0.2，0.4，0.5，0.75，0.85 和1 mg·mL-1染料木苷对照品溶液与0.067，0.133，0.200，0.267，0.333，0.400 和0.667 mg·mL-1的槐角苷对照品溶液。对上述对照品按顺序分别取10μL 的溶液分别进样，将每个浓度重复3 次，得回归方程。回归方程经线性拟合后得到为：

式中：X 为对照品浓度(mg·mL-1)，YA、YB分别为染料木苷和槐角苷标准品溶液对应的峰面积。

2.3 样品中染料木苷和槐角苷的含量测定

称取槐角原料5 g，加入乙醇溶液后一同放入匀浆机里匀浆处理一段时间，之后再将溶液超声处理。超声结束后，对提取液进行减压抽滤，取上清液1 ml，加甲醇稀释10 倍，再取稀释溶液2 ml，经0.45 μm 微孔滤膜过滤，HPLC 检测得到稀释溶液样品中染料木苷与槐角苷的峰面积，将其带入回归方程，得到染料木苷和槐角苷的浓度。两种目标成分得率计算公式：

式中：Y 为提取产物染料木苷或槐角苷的得率(mg·g-1)，c 为稀释溶液浓度(mg·mL-1)，v 为稀释溶液的体积(mL)，m 为加入的槐角的质量(mg)。

2.4 匀浆-超声协同提取染料木苷和槐角苷

精密称取槐角原料5 g，加入一定体积分数的乙醇溶液后放入匀浆机中在特定的匀浆速率下匀浆处理一段时间后，将溶液转移到烧杯中，之后放入超声提取仪中进行超声处理，反应结束后，再将提取液减压抽滤，之后从上清液中吸取1 mL,用甲醇稀释10 倍，经0.45 μm 微孔滤膜过滤后，进行HPLC 检测。在其他条件不变的前提下，分别改变乙醇体积分数、液料比、匀浆时间、匀浆速率、超声时间、超声功率、超声空化时间、超声缓冲时间这些因素，确定最佳提取方案。

3 结果与讨论

3.1 乙醇体积分数的影响

以乙醇为提取溶剂，在液料比20 mL·g-1，匀浆时间3 min，匀浆速率22 000 r·min-1，超声时间30 min，超声功率250 W，超声空化时间2 s，超声间隔时间2 s 的条件下，选取乙醇溶液浓度0%，10%，30%，50%，70%和90%进行匀浆-超声协同提取单因素试验，实验结果见图1。由图1 可以看出，染料木苷、槐角苷的得率随着乙醇体积分数的升高，逐渐变大，推测是因为随着有机溶剂浓度升高，溶剂的极性逐渐降低，染料木苷和槐角苷根据相似相溶原理，溶解量增加所致。在乙醇体积分数为50%时，二者得率达到最大，之后略有下降，可能是因为溶剂浓度过高，脂溶性变大，导致物料中油脂成分析出，使目标产物的溶解量相对减少。因此选择50%的乙醇作为最佳溶液浓度。

图1 乙醇体积分数的影响Fig.1 Effects of ethanol volume fraction on the yield of genistin and sophoricoside

3.2 液料比的影响

在其他提取条件不变的情况下，选择液料比10，15，20，25 和30 mL·g-1进行实验。实验结果如图2 所示，染料木苷、槐角苷的得率随着液料比增大而逐渐变大，当液料比超过20 mL·g-1时，得率不再有显著增长，因此为了节约原料，降低成本，选择20 mL·g-1作为最佳液料比。

图2 液料比的影响Fig.2 Effects of liquid-solid ratio on the yield of genistin and sophoricoside

3.3 匀浆时间的影响

其他条件不变，选择匀浆时间分别为1，2，3，4 和5 min 进行提取实验，实验结果见图3。由图3可知，两个目标产物的得率随着匀浆时间的增加而变大，这是因为匀浆时间越长，物料粉碎效果越好，促进了槐角异黄酮苷的释放和溶解。当匀浆时间增加到3 min 时，得率增加趋势趋于平缓，说明粉碎程度已经接近最好，因此选择3 min 作为最佳匀浆时间。

图3 匀浆时间的影响Fig.3 Effects of homogenate time on the yield of genistin and sophoricoside

3.4 匀浆速率的影响

在其他条件不变下，选择匀浆速率分别为19 000，21 000，22 000，22 600 和23 400 r·min-1进行提取实验。实验结果如图4 所示，随着匀浆速率的增大，两个目标产物的得率逐渐增大，因为匀浆速率越大，物料的粉碎越快，粉碎程度越好。当速率超过22 000 r·min-1，得率几乎不再有明显变化，因此选择22 000 r·min-1作为最佳匀浆速率。

图4 匀浆速率的影响Fig.4 Effects of homogenate speed on the yield of genistin and sophoricoside

3.5 超声时间的影响

为考察超声时间对提取效率的影响，选择超声时间分别为20，25，30，35 和40 min，其他提取参数不变，进行匀浆-超声协同提取单因素试验，实验结果见图5。从图五能够看出，在20—35 min 时，染料木苷与槐角苷得率迅速升高，当超声时间超过35 min 时，得率基本持平，说明超声波促进了目标产物在溶剂中的释放和溶解，但当释放达到一定的峰值时，超声时间再延长也不会对提取效率产生明显影响。因此选择35 min 作为最佳超声时间。

图5 超声时间的影响Fig.5 Effects of ultrasonic time on the yield of genistin and sophoricoside

3.6 超声功率的影响

在乙醇体积分数为50%，液料比20 mL·g-1，匀浆时间3 min，匀浆速率22 000 r·min-1，超声时间35 min，超声空化时间2 s，超声间隔时间2 s 的条件下，选择超声功率分别为200，250，300，350 和400 W 进行提取实验，实验结果见图6。从图六能够看出，两个目标产物的得率随着超声功率的增大而逐渐增加，当功率达到350 w 后，得率达到最大，之后功率继续增大，得率则趋于稳定，所以选择350 W作为最佳超声功率。

图6 超声功率的影响Fig.6 Effects of ultrasonic power on the yield of genistin and sophoricoside

3.7 空化时间和缓冲时间的影响

在其他条件如3.6 中一样时，控制不同的超声空化时间(1.0—3.0 s)和超声缓冲时间(0.5—2.5 s)，不同超声空化时间的产物得率的影响如图7 所示，两个目标产物随着超声空化时间的增加，其得率逐渐增加，推测是因为空化时间越长，有效超声的时间则越长，目标产物的溶解和扩散越快。当超声空化时间超过2.5 s 时，得率不再有明显变化，考虑到能耗的因素，因此选择2.5 s 作为最佳超声空化时间。

图7 空化时间的影响Fig.7 Effects of cavitation time on the yield of genistin and sophoricoside

图8 显示了不同缓冲时间的染料木苷和槐角苷得率的影响，从图8 能够看出，缓冲时间从0.5 s 增长到1.5 s 时，两种槐角异黄酮苷的得率相似，之后缓冲时间再增长，得率开始下降，由于不间断长时间工作容易形成空载，使仪器寿命缩短。所以从保护仪器，减少能耗的角度考虑，选择1.5 s 为最佳超声缓冲时间。

图8 超声间隔时间的影响Fig.8 Effects of buffer time on the yield of genistin and sophoricoside

4 结论

实验选用乙醇作为提取溶剂，通过单因素实验得到匀浆-超声协同提取染料木苷与槐角苷的最佳提取工艺为：乙醇体积分数50%，液料比20 mL·g-1，匀浆时间3 min，匀浆速率22 000 r·min-1，超声时间35 min，超声功率350 W，超声空化时间2.5 s，超声缓冲时间1.5 s。此工艺下染料木苷和槐角苷的得率分别为33.70 mg·g-1和95.02 mg·g-1。匀浆-超声协同提取法具有环保、稳定和高效的优势，具有较好的应用前景。