化学发光免疫分析法简介及其在动物疫病检测中的研究进展

封莹洁，张同锋，罗 娟，尚佳静，孟 鸽，于晓慧，蒋文明，刘华雷，范春艳，李 阳

（1. 河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北邯郸 056038；2. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；3.山东省郓城县行政审批服务局，山东郓城 274700）

动物疫病在全球范围内蔓延，给畜禽养殖业带来严重危害，同时部分动物疫病也威胁到了人类健康。自波及全球的登革热、新型冠状病毒感染在人群中暴发以来[1-2]，动物疫情更加引起了人们的关注。当前，动物疫病防控形势日益严峻，因此促进畜牧业健康稳定发展并为食品安全、人类生命安全提供保障仍是一项重要任务。为应对各类动物疫病的发生发展，动物疫病检测和诊断方法不断发展，其中常用的检测技术有聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光定量PCR（qPCR）、环介导等温扩增（LAMP）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等[3-6]。这些技术对于检测人员的经验要求较高，操作步骤繁琐，不适用于大批量分析检测待测样品。为更加高效检测动物疫病，并做出正确的应对措施，需要建立操作简单、准确性强、灵敏度高和特异性好的检测方法。

化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA）灵敏度高，线性范围宽，不受散射光干扰，不产生放射性污染物，具有设备简单、可自动化等优势，更适合大批量样品的检测分析。CLIA 将化学发光测定技术和免疫反应相结合，适用于各种抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析[7]。它是继放射性免疫分析、酶免疫分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后，发展起来的一项新的免疫测定技术[8]，基于抗体与抗原高灵敏性识别和高特异性结合的优势，其在生命科学、临床诊断、环境监测和食品安全等领域得到广泛应用[7，9-12]。目前CLIA 在动物疫病检测领域仍处于发展阶段。本文就CLIA 在动物疫病检测中的研究进展进行综述，以期为CLIA 检测技术的后续研究提供参考。

1 CLIA 原理

CLIA 是将化学发光的底物或催化剂标记到特异性抗原（抗体）上，与待测物质发生特异性反应后，加入相关物质或者通过电压激发使其发光，根据光信号强度来确定待测物质含量的方法[13]。Wang[14]等筛选了具有高亲和力的血管加压素（copeptin，CPP）单克隆抗体应用于CLIA，将抗体包被磁性颗粒（MPs），用碱性磷酸盐（AP）作为标记物与抗CPP 抗体、戊二醛偶联，使用自动化学发光免疫测定仪器（Limiray1200）检测CPP。该仪器基于使用抗CPP 抗体包被的MPs 和AP 标记的抗CPP 抗体进行夹心免疫测定。原理见图1。

图1 基于MPs 的用于CPP 定量检测的全自动CLIA[15]

2 CLIA 分类

CLIA 根据发光剂的不同大致被分为3 类——直接化学发光免疫分析（DCLIA）、化学发光酶免疫分析（CLEIA）和电化学发光免疫分析（ECLIA）。

2.1 DCLIA

DCLIA 是直接利用发光标记物与抗原或抗体结合并对其标记的一种典型检测方法。在DCLIA检测法中最重要的一环是发光剂的添加，发光剂的加入会使反应产生化学发光，从而使检测结果直观化。鲁米诺类、吖啶酯类是近几年常用的发光剂[15]。鲁米诺类在常温下是一种呈黄色晶体或者米黄色粉末状的稳定性较好的化学试剂。对鲁米诺类及其衍生物的氨基进行烷基化可以提高其发光效率从而使检测结果更加清晰[16]。科研人员通过不断探索发现，鲁米诺类发光剂还可以和其他物质结合使用，起到增强化学发光和增敏的作用[17]，近年来针对鲁米诺双色荧光也有诸多研究[18-19]。对于吖啶类衍生物，吖啶酯环上9-位的碳原子上链接着具有特征结构的取代基。根据取代基的不同，吖啶类可分为吖啶酯类和吖啶磺酰胺类[20]。吖啶酯类及其衍生物作为发光剂的原理是其在pH 为4.5～5.5 时，可由绿色变为蓝色，以此来作为荧光指示剂[21]。相比于鲁米诺类，吖啶酯类与蛋白质偶联后产生的发光量子更多，生物活性几乎没有损耗[22]，由此具有特殊性能的吖啶酯类发光剂在生物、医学等方面都有广泛的应用前景[23-24]。

2.2 CLEIA

CLEIA 是一种用酶标抗原或者酶标抗体与发光底物产生化学发光反应并根据光子信号强度对抗体或抗原进行定性或定量分析的一种检测技术。CLEIA 中使用的酶标记物是以金刚烷基1,2-二氧杂环丁烷芳基磷酸（AMPPD）为底物的碱性磷酸酶和以鲁米诺或其衍生物为底物的辣根过氧化物酶[25]。CLEIA 的酶标记抗原或抗体结合稳定，发光持续时间长，便于记录和测定，但反应速度慢、表面积低、酶容纳量小[26]。以MPs 和纳米材料作为载体，可使此方法变得高效快捷，有着很好的应用前景[27-29]。与DCLIA 相比，CLEIA 是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，其灵敏度相对更高，但速度慢，酶活性容易受外界影响。目前CLEIA 更多被用于样品的定量分析。

2.3 ECLIA

电化学发光（ECL）作为一种由电极附近发生的电化学反应所引发的化学发光，不仅具有化学发光方法的高灵敏度和电化学的时空可控性，还具有接近零背景信号的显著优势[30]。ECL 开发中最重要的突破是ECLIA，它将特异性免疫反应与ECL的内在特征相结合，能够以快速的分析程序和简单的设备对生物标志物进行灵敏、特异地检测[31]。ECLIA 可分为底物电化学发光免疫反应和标记物电化学发光免疫反应两种[32]。前者与ELISA 在抗原抗体免疫反应操作时的步骤一致，只是最后一步使用电化学发光剂检测光信号。ECLIA 加入了酶进行反应可使测定信号放大，但有些反应体系也可在无酶催化时自发发光，因此为了避免空白干扰，所用试剂需要在使用前进行混合[32]。后者是用电化学发光剂直接标记抗原或抗体。常用的标记物是CdTe 量子和三联吡啶钌[33-34]。与其他检测技术相比，ECLIA 因其灵敏度高、线性范围宽、仪器简单、操作简便等特点在检测分析领域受到广泛关注[35-37]。

3 CLIA 发展

目前，CLIA 技术多应用于动物药物残留检测，对于动物疫病检测的研究仍处于早期阶段。近几年，随着与MPs、纳米颗粒等新型材料，以及与微流控芯片技术和新传感器技术等的联合使用，CLIA检测方法的灵敏度、特异性和检测效率都有所提升[38-42]，基于此，未来开发全自动、便携式、高通量的检测仪器将成为CLIA 技术的发展方向。

3.1 CLIA 中信号放大载体的应用

在CLIA 技术中，联吡啶钌等材料具有良好的发光性能，但是存在价格昂贵以及环境污染等问题，所以使用受到一定的限制。葛芝莉[43]将纳米颗粒运用到联吡啶钌的固定化中，发现其在降低污染、节省昂贵材料的同时，还提高了导电性，从而增强了电化学发光强度。字琴江等[44]将磁球作为免疫反应的固相载体去捕获癌胚抗原，与其他固相载体相比，该方法检测癌胚抗原的发光强度更强并且有更低的检出限。Feng 等[45]建立了一种快速灵敏的MPs-CLEIA，相比于普通CLEIA 分析法，其免疫测定时间更短。

3.2 CLIA 与新技术的联用

在实际应用中，常常需要大批量检测低丰度样品，因此发展自动、高灵敏的CLIA 是其主要发展方向。不同技术与CLIA 联用可以有不同效果。CLIA 与CCD 图像传感器联用，可以在短时间内同时检测大量样品[46]，带旋转轴的CLIA 可实现自动化操作[47]等。Sun 等[48]开发了一种基于多信号放大策略的微流控化学发光生物传感器，用于大肠杆菌O157:H7 的快速超灵敏检测。微流控装置可实现与化学发光试剂的高效混合，具有增强发光信号、减短分析时间以及检测限低等优点，可快速检测病原体。Li 等[49]采用硅烷化微流控芯片微通道共价固定捕获抗体（Abs）制备免疫装置，并且用金纳米颗粒（AuNPs）作为抗体信号放大的标记，比以往单纯抗体-辣根过氧化物（HRP）偶联相比，其灵敏度提高了7.4 倍。此外，一种名为酪胺信号放大（TSA）的酶介导系统被应用于蛋白质、核酸和细胞的电化学分析[50-51]。酪胺可以共价结合到相邻的蛋白质残基上，之后更多的HRP 通过反应累计使得信号放大。Zong 等[52]将TSA 系统引入多HRP 包裹的AuNPs，并将这种双信号放大策略应用于化学发光分析，再通过免疫传感器阵列，开发了一种新型超灵敏的化学发光成像技术，可同时检测柑橘素、黄曲霉毒素B 和赭曲霉毒素A 等霉菌毒素。

4 CLIA 在动物疫病检测中的研究进展

随着国内外对CLIA 技术的研究愈加深入，研究者发现其在动物疫病检测领域表现出较好的发展前景，但目前CLIA 技术在动物检疫方面的应用仍处于发展阶段。近几年新材料和新技术的发展，推动了CLIA 在兽医行业的研究及应用。

4.1 病毒性疫病

孙雨等[53]将A 型口蹄疫病毒VP1 融合蛋白与相关单克隆抗体结合建立了针对A 型口蹄疫病毒抗体的化学发光检测试剂盒。结果表明，该方法特异性强、灵敏度高、操作简单，具有较高的应用推广价值。马震原等[54]建立了快速定量猪伪狂犬病病毒gB 蛋白抗体的CLIA，其特异性较好，与猪细小病毒、圆环病毒等均无交叉反应，可检测到最大稀释度为1:2 048 的猪伪狂犬病病毒gB 抗体阳性血清国家参考品（Z89），具有良好的特异性和敏感性，并且可在45 min 内完成检测。钱榜等[55]将小反刍兽疫病毒H 蛋白的B 细胞表位串联后作为检测抗原，优化血清和酶标二抗反应时间，用ROC 曲线分析确定检测临界值，建立了针对小反刍兽疫病毒H 蛋白的CLIA。用建立的CLIA和商品化ELISA 检测试剂盒做对比，当血清稀释到1:800 时，建立的CLIA 仍显示阳性，而此时ELISA 试剂盒显示阴性，说明建立的CLIA 灵敏度更高。孙雨等[56]采用双抗夹心法检测禽白血病病毒抗原，先将待检抗原与相关单克隆抗体以及酶标抗体形成复合物，再加入化学发光剂来读取发光值，通过计算禽白血病病毒P27 抗原的计量值来判定阴阳性，结果发现该方法最低检测限为1:512 000，可以实现抗体定量检测，在检测性能方面更具优势。Zhou 等[57]将HRP 和检测抗体同时固定在金纳米颗粒表面，形成基于金纳米颗粒的纳米探针。将该纳米探针应用于双抗夹心法，通过测量HRP-鲁米诺与过氧化氢（H2O2）反应引起的发光强度，可确定猪细小病毒感染的存在。该方法的检测限远低于ELISA 方法。

4.2 细菌性疫病

Mao 等[58]建立了基于杂交纳米花检测肠炎沙门氏菌的磁化CLIA，将HRP 和抗体嵌入磷酸氢钙中制备复合体（HAC），把制备的HAC 杂交纳米花作为信号标签用于肠炎沙门氏菌检测。Hu等[59]建立了一种基于AuCl4-增强鲁米诺化学发光反应的CLIA，其可以实现胸膜肺炎放线杆菌的ApxIV 抗体检测。该方法与间接血凝试验（IHA）和ELISA 相比，在实用性和灵敏度方面展现出明显优势。袁世超等[60]建立了用于检测结核分枝杆菌特异性γ- 干扰素的CLIA，并对建立的化学发光体系进行评价，结果发现此方法最低检出限为0.66 pg/mL，与ELISA 方法相对比，检测结果的总符合率达到99.01%，可用于结核病的临床快速检查。Sharma 等[61]设计了一种新的催化生物纳米标记物，并制备了用于检测炭疽杆菌抗原的超灵敏新型电化学免疫传感器。Sun 等[62]将电化学分析法与生物传感器相结合用于检测金黄色葡萄球菌，发现这种方法最低可检测到3.3×10-16mol/L，具有检测限低、灵敏度高优势。辛思培等[63]针对肠出血性大肠杆菌O157:H7 建立了双抗夹心CLEIA，其最低检测限为2.5×104CFU/mL，与ELISA 相比灵敏度更高。

4.3 寄生虫病

Li 等[64]以环状绦虫亚端粒可变分泌蛋白（SVSP）为血清诊断抗原，研制了一种CLIA，其检测时限小于4.5 h。当检测血清样本的阳性百分比（PP）临界值为26.1%时，CLIA 的敏感性和特异性分别为98.8%和97.5%，研究表明建立的CLIA 法具有较高的特异性、灵敏度和可靠性，可作为环形绦虫感染流行病学调查的快速检测方法。青宪[65]研究了针对检测日本血吸虫抗体的CLIA，将日本血吸虫抗原固定在磁性纳米粒子表面，先使抗原同日本血吸虫抗体结合，再与二抗形成夹心复合物，以此来检测日本血吸虫抗体含量。该方法步骤简单，抗干扰性好。Holec-Gąsior 等[66]针对弓形虫建立了CLIA，其灵敏度高于ELISA，可用作弓形虫病诊断，目前已得到广泛应用。

5 总结与展望

CLIA 是将免疫反应和化学发光结合起来的一种高灵敏度的免疫检测方法，并且具有操作简单、线性范围宽等特点，可以对待检物质进行定量分析。由于此技术涉及化学类、生物类等多个学科，检测过程中易出现仪器故障，且存在试剂稳定性差等问题，至今在我国动物疫病检测中仍处于发展阶段。近年来，CLIA 与其他新技术的联用以及与MPs 等新型材料的应用和新型反应发光剂的出现，进一步提高了CLIA 的检测效率。随着人们生活水平的提高，人兽共患病和食品安全愈发得到重视，因此CLIA 技术也将在动物疫病诊断、生物安全防护、食品检测、环境监测等方面发挥更重要的作用。