新疆阿拉尔市流浪猫源蜱种类鉴定及其携带立克次体PCR 检测

司俊飞，赫永强，张振杰，朱婷婷，2，张 旭，曹梦雅，赵爱云，齐 萌

（1. 塔里木大学动物科学与技术学院，新疆阿拉尔 843300；2. 新疆生产建设兵团第九师农业科学研究所（畜牧科学研究所），新疆额敏 834601）

蜱是常见的吸血传播媒介，在世界范围内广泛分布，可传播细菌、病毒、原虫等多种病原[1]。蜱种类繁多，宿主谱广，不同地区家猫和流浪猫感染蜱的种类存在地理分布差异。Horak 等[2]在南非调查发现，家猫体表可寄生13 种硬蜱和1 种软蜱，以椭圆血蜱（Haemaphysaliselliptica）为优势寄生种类；Saleh 等[3]在美国调查发现，猫体表蜱以美洲花蜱（Amblyommaamericanum）为优势寄生种类；Chao 等[4]在我国台湾省1 只流浪猫体表采集了15 只蜱，经鉴定均为卵形硬蜱（I.ovatus）。

立克次体主要包括斑疹伤寒立克次体（typhus groupRickettsias，TGR）和斑点热群立克次体（spotted fever groupRickettsias，SFGR）。SFGR是专性寄生于细胞内的革兰氏阴性原核生物，主要通过蜱传播至人和动物，引起发热、头痛、皮疹、肌肉疼痛、局部淋巴结病变等临床症状[5]。目前，已发现至少28 种SFGR，其宿主主要是蜱，并可经蜱卵进行垂直传播[6]。在国外，猫常见感染SFGR。Sirirat 等[7]在泰国猫中检测到SFGR，感染率为4.76%（2/42）；Izzard 等[8]在澳大利亚猫血清中检测到SFGR，感染率为59.33%（89/150）。本调查利用形态学和分子生物学方法鉴定新疆阿拉尔市流浪猫源蜱种类，并对其携带的立克次体进行PCR 检测，以期为我国猫源寄生蜱及蜱传病研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 蜱采集与处理

2023 年4 月，于新疆阿拉尔市某居民小区内，对4 只流浪猫进行体表寄生蜱检查，在1 只猫体表采集蜱3 只，分别编号为C1、C2 和C3，将其置于2 mL 离心管中保存。

1.2 主要试剂与仪器

组织DNA 提取试剂盒、2×EasyTaqPCR Super Mix（+dye）、DL 2 000 DNA Marker，均购自北京全式金生物技术股份有限公司；SMZ18 体视显微镜，购自Nikon 公司；Sorvall Legend Micro 17 型微量离心机，购自Thermo Fisher Scientific 公司；MC proS 型梯度PCR 仪，购自Eppendorf 公司；DYY-7C 型稳压稳流电泳仪及JY 系列电泳槽，购自北京六一生物科技有限公司；Gel Doc XR+型凝胶成像系统，购自Bio-Rad 公司。

1.3 形态学观察

参考陈泽等主编的《蜱的系统分类学》[9]和邓国藩等主编的《中国经济昆虫志》[10]第三十九册，使用体式显微镜观察蜱的假头基、缘垛、气门板、眼、足、肛沟、肛门、肛毛等部位，进行种类鉴定。

1.4 蜱DNA 提取

将3 只经形态学鉴定后的蜱分别用灭菌双蒸水反复冲洗3 次。使用手持式电动组织研磨器进行研磨，然后参考组织DNA 提取试剂盒的操作说明进行基因组DNA 提取，将获得的基因组DNA 置于-20 ℃保存备用。

1.5 蜱线粒体SSU rRNA 基因和COX I 基因PCR扩增

参照方晨等[11]的报道设计蜱线粒体SSU rRNA 和COXI基因引物，引物序列信息见表1，由苏州金维智生物科技有限公司合成。

表1 鉴定蜱种类的引物序列及其目的条带大小

反应体系：模板DNA 1.0 μL，2×EasyTaqPCR Super Mix（+dye）12.5 μL， 上下游引物（20 μmol/L）各0.3 μL，ddH2O 10.9 μL，共计25.0 μL。COXI和SSU rRNA 基因扩增条件均为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃ 10 min。每次PCR 扩增以残缘璃眼蜱DNA 为阳性对照，灭菌双蒸水为阴性对照。扩增结束后，取5.0 μL PCR 产物于琼脂糖凝胶（10 g/L）中进行电泳观察。

1.6 立克次体OmpA、OmpB 基因PCR 扩增

参照刘城成等[12]的报道设计检测立克次体的OmpA和OmpB基因引物，引物序列信息见表2，由苏州金维智生物科技有限公司合成。

表2 检测立克次体的引物序列及其目的条带

PCR 反应体系同1.5。OmpA基因扩增条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35 个循环；72 ℃ 8 min。OmpB基因扩增条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，35 个循环；72 ℃ 8 min。每次PCR 扩增以图兰扇头蜱（Rhipicephalusturanicus）拉氏立克次体（Rickettsiaraoultii）DNA 为阳性对照，灭菌双蒸水为阴性对照。扩增结束后，取5.0 μL PCR 产物于琼脂糖凝胶（10 g/L）中进行电泳观察。

1.7 序列比对及种系进化分析

基于蜱线粒体SSU rRNA 和COXI基因，将蜱PCR 扩增阳性产物送至苏州金维智生物科技有限公司进行双向测序和序列拼接，在NCBI 数据库中进行BLAST 搜索，应用MEGA 7.0 软件对所获序列进行比对分析，鉴定蜱的种类。基于立克次体OmpA和OmpB基因，将阳性产物送至苏州金维智生物科技有限公司进行双向测序和序列拼接，应用MEGA 7.0 软件比对分析本调查所获得的立克次体序列，鉴定其种类；在NCBI 数据库中分别下载不同宿主来源的SFGR 序列，使用MEGA 7.0 软件，选择邻接法（neighhor-joining，NJ 法）构建种系发育进化树。根据种系发育树分支，分析不同SFGR的遗传进化关系。

2 结果

2.1 蜱形态学鉴定

经肉眼观察，3 只蜱体色单一，均为雌蜱。使用体式显微镜对蜱观察：假头基宽短呈六角形，侧角明显；具眼呈卵圆形，略微凸起，盾板褐色且长大于宽，后缘浅弧型凸出；体呈卵圆形，第I 基节短，背、腹面可见，4 对足，细长均一，附节末端有小齿突，后缘圆润；气门板呈短逗点型，长大于宽（图1）。经形态学观察，初步鉴定3 只蜱均为图兰扇头蜱。

图1 蜱形态学鉴定结果

2.2 蜱DNA 样本PCR 扩增和种类鉴定

基于蜱线粒体SSU rRNA 和COXI基因对提取的蜱DNA 样本进行PCR 扩增，结果分别成功扩增出大小约460 和850 bp 的目的片段（图2～3），均与预期目的片段大小一致。

图2 蜱线粒体SSU rRNA 基因PCR 扩增结果

图3 蜱线粒体COX I 基因PCR 扩增结果

对于SSU rRNA 基因序列，在3 条蜱序列中，有2 条与新疆策勒县绵羊体表寄生的图兰扇头蜱序列（GenBank 序列登录号KY583074）同源性为100%；剩余1 条与该参考序列的同源性为99.73%，其第340 核苷酸位置处存在1 个碱基替换（A →G）。经序列比对，鉴定3 只蜱均为图兰扇头蜱。

对于COXI基因序列，在3 条蜱序列中，有2 条与新疆阿拉山口市绵羊体表寄生的图兰扇头蜱序列（GenBank 序列登录号KU364303）同源性为100%；剩余1 条与该参考序列的同源性为99.87%，其第508 核苷酸位置处存在1 个碱基替换（A →G）。经序列比对，鉴定3 只蜱均为图兰扇头蜱。

2.3 蜱DNA 样本中立克次体PCR 检测

基于OmpA和OmpB基因对立克次体进行PCR扩增，结果分别扩增到520 bp（图4）和618 bp（图5）的目的片段，与预期目的片段大小一致。

图4 立克次体OmpA 基因PCR 扩增结果

图5 立克次体OmpB 基因PCR 扩增结果

2.4 立克次体序列遗传进化分析

在OmpA基因位点，获得2 条序列，二者与新疆石河子市图兰扇头蜱体内检测到的暂定巴布瑞立克次体（CandidatusR.barbariae）序列（Genbank序列登录号MF002506）同源性均为100%，将其命名为OS1；在OmpB基因位点，获得2 条序列，二者与黎巴嫩具环扇头蜱（Rhipicephalus annulatus）体内检测到的暂定巴布瑞立克次体序列（GenBank 序列登录号KY233293）同源性均为100%，将其命名为OB1。因此，本研究获得的2个立克次体样本均被鉴定为暂定巴布瑞立克次体。

基于立克次体OmpA基因序列构建的种系发育进化树（图6）显示：所获OS1 序列与我国、黎巴嫩、印度的蜱源暂定巴布瑞立克次体聚成一支，与其他蜱源非洲立克次体（R.africae）、西伯利亚立克次体（R.sibirica）、康氏立克次体（R.conorii）、立氏立克次体（R.rickettsii）聚类形成一个大群，而与拉氏立克次体、马赛立克次体（R.massiliae）形成不同群组。

图6 基于立克次体OmpA 序列构建的种系发育进化树

基于立克次体OmpB基因序列构建的种系发育进化树（图7）显示：所获OB1 序列与我国、黎巴嫩、葡萄牙、斯威士兰的蜱源暂定巴布瑞立克次体聚成一支，与其他蜱源拉氏立克次体和马赛立克次体聚类形成一个大群，而与非洲立克次体、西伯利亚立克次体、拉氏立克次体、康氏立克次体形成不同群组。

图7 基于立克次体OmpB 序列构建的种系发育进化树

3 讨论

蜱的种类分布与地理环境密切相关。在意大利，Pennisi1 等[13]在308 只猫体表进行检查，发现37 只猫体表有蜱寄生，每只猫寄生蜱1～22 只，共采集到132 只蜱，鉴定出2 属5 种蜱，以奋氏硬蜱（I.ventalloi）为优势蜱种（46.97%，62/132）。在美国，Saleh 等[3]对体表寄生蜱的336 只猫进行检查，发现每只猫寄生蜱1～38 只，共采集891 只蜱，鉴定出5 属12 种硬蜱，以美洲花蜱为优势寄生种类（343/891，38.50%）。在新疆南疆开展的调查显示，扇头蜱是新疆南疆羊和犬寄生的优势蜱种类。郗宇等[14]在新疆南疆阿瓦提县以及阿拉尔附近团场的绵羊和狗体表共采集蜱1 340 只，其中图兰扇头蜱1 331 只，占总数的99.32%；刘永宏等[15]在新疆阿图什市羊体表共采集到232 只蜱，其中扇头蜱属占42.24%；李正等[16]在新疆和田地区羊养殖场的绵羊体表共采集到914 只蜱，其中图兰扇头蜱532只，占总数的58.46%。本次调查在阿拉尔市猫体表采集到的3 只蜱均为图兰扇头蜱，说明图兰扇头蜱是南疆地区流行的优势蜱种。

蜱在立克次体感染脊椎动物的过程中起到了重要作用。在已建立的立克次体分子检测方法中，OmpA和OmpB基因是诊断立克次体的常用位点，其中OmpA对SFGR 基因型或亚型的鉴定具有重要意义[17]。郗宇等[14]基于立克次体OmpA基因位点，对新疆南疆9 个地区羊源蜱进行立克次体检测，发现了4 种立克次体，其中有3 种（马赛立克次体、康氏立克次体、暂定巴布瑞立克次体）来自图兰扇头蜱，其中暂定巴瑞立克次体的感染率较高，为91.23%（49/53）。李飞等[18]在新疆南疆31 个地区共采集1 144 只羊源图兰扇头蜱，从中挑取93只进行立克次体OmpA和OmpB基因检测，发现阳性率为16.13%（15/93），且均为暂定巴布瑞立克次体。本次调查在猫体表采集3 只图兰扇头蜱，其中2 只携带暂定巴瑞立克次体，结果与上述调查研究一致。本调查结果提示，新疆南疆地区不同宿主源蜱携带的立克次体优势种是暂定巴瑞立克次体。

综上，新疆阿拉尔市猫体表存在图兰扇头蜱寄生，可携带暂定巴布瑞立克次体。本研究结果为我国猫源寄生蜱及蜱传病的研究提供了基础资料。