血小板应答蛋白1在双侧卵巢切除大鼠阴道壁中的表达

朱芳谊，洪莉，陈茂，肖雅，黄筱雨，陈丽颖

武汉大学人民医院妇产科，湖北武汉 430060

盆腔脏器脱垂（pelvic organ prolapse，POP）是指由于盆底支持结构薄弱进而导致盆腔器官移位及功能异常的盆腔功能障碍性疾病，阴道前壁是临床上最常见的脱垂部位。POP患者可能伴有不同程度的盆腔疼痛、排尿异常、大便失禁或排便障碍等不适症状，造成生活质量严重下降[1]；且其较高的手术率也给公共卫生系统带来沉重的经济负担。据统计，女性终身接受POP手术的风险为12%～19%，阴道脱垂已成为绝经后女性接受子宫切除术最常见的手术指征之一[2]。然而POP的发病机制仍未得到充分解释，这给相关诊疗方案的制定带来重大困难。研究显示POP是一种多因素的结缔组织疾病，绝经是其主要危险因素之一，绝经后女性的雌激素水平急剧下降，造成阴道壁萎缩及炎症，并通过影响胶原纤维的代谢导致盆腔结缔组织支持功能障碍，进而诱发POP[3]。血小板应答蛋白1（thrombospondin-1，THBS1）是血小板凝血酶蛋白家族中一种可由成纤维细胞、平滑肌细胞等多种细胞分泌的钙结合性糖蛋白，在子宫内膜、阴道壁等多种人体组织中广泛表达[4]。作为一种具有三聚体复合结构的基质细胞蛋白，THBS1可通过结合细胞外基质中的受体和特定蛋白质，参与调控细胞骨架、细胞迁移、细胞凋亡、止血和血管生成等多项生理活动。研究显示THBS1在生理状态下表达较少，但在组织受损时表达上调，并在慢性纤维化疾病中持续存在，参与纤维化和炎症相关的多个分子通路的激活[5-6]。体外实验证实雌激素处理可使人体子宫来源的成纤维细胞中的THBS1表达下调[7]。本研究通过切除大鼠双侧卵巢模拟绝经后低雌激素环境，构建大鼠雌激素缺乏模型；观察其阴道壁的形态结构及THBS1的表达变化，初步探讨雌激素缺乏是否通过上调THBS1表达影响阴道壁中胶原纤维代谢，参与POP的发病进程，为未来POP发病机制的相关研究提供思路及研究靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选用无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级健康的3月龄未生产过的SD大鼠24只，体质量332～367g，平均（350.0±17.2）g，由武汉大学人民医院动物实验中心提供，对动物的处置符合动物伦理学要求[实验动物许可证号：TY20220087；伦理审批号：WDRM动（福）第20200805号]。24只大鼠随机分为假手术组和实验组，每组各12只。

1.1.2 主要试剂和仪器 抗THBS1抗体（Santa Cruz Biotechnology生物公司）；17-β-雌二醇酶联免疫吸附测定试剂盒（Abcam，ab108667）；免疫组织化学试剂盒、组织固定液（武汉赛维尔生物科技有限公司）；蛋白上样缓冲液（谷歌生物技术有限公司）；正置荧光显微镜（日本，Olympus）；ChemiDocTMTouch化学发光仪（美国，BIO-RAD）；EnSight酶标仪（美国，Perkin Elme）；BSA124S-CW分析天平（德国，Sartorius）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立 将大鼠放入麻醉诱导盒（4%异氟烷），待大鼠麻醉后将其取出固定在手术台上，利用麻醉呼吸面罩维持麻醉（2%异氟烷），使其保持深度麻醉。除去腰背部毛发，消毒皮肤，无菌条件下经腰背部正中纵行切口进入腹腔背侧，实验组大鼠切除双侧卵巢；假手术组大鼠切除双侧卵巢下方与卵巢相同重量的脂肪组织。术后给予青霉素预防感染1周，每周监测大鼠体质量。常规饲养至12周后处死大鼠，取子宫、阴道壁组织及静脉血进行分析。

1.2.2 取材方法 处死前从大鼠尾静脉取血，抗凝静置10min后，4°C下1500×g离心10min，收集血清并转移至–80℃冰箱备用。采用断椎法处死大鼠，打开盆腔，暴露盆底，分离筋膜与脂肪组织，取子宫及阴道壁组织，并将阴道壁沿中线分成两块，约0.5cm×0.5cm×0.5cm，生理盐水反复冲洗，一块放入–80℃冰箱中低温保存；另一块采用组织固定液固定，常规石蜡包埋、切片。

1.2.3 酶联免疫吸附测定 按照酶联免疫吸附测定试剂盒说明进行相关操作，将25μl血清样品、对照组及标准组溶液分别加入酶标板，37℃孵育2h。用洗涤液漂洗3遍，加入100μl TMB底物，室温避光孵育30min，加入终止液并轻摇，30min内在酶标仪上读取各孔在450nm处的吸光度。制作标准曲线，计算血清样品内雌二醇含量。

1.2.4 免疫组织化学染色 染色采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（streptavidin-perosidase，SP）法，按试剂盒说明进行相关操作。切片在60℃抗原修复液中加热30min，用分级醇系脱蜡再水化，一抗按1∶100稀释。光镜下观察，细胞质或细胞膜中有棕色颗粒为阳性表达。免疫活性用积分光密度（integral optical density，IOD）值量化，使用Image J 6.0软件通过高分辨摄取图像信号测定灰度值，用平均灰度值表示THBS1蛋白的表达，平均密度=IOD/面积。

1.2.5 Masson染色 切片脱蜡，铁苏木素染色7min，水洗，酸性乙醇分化液分化，水洗，丽春红酸性品红液染色8min，水洗，1%磷钼酸水溶液处理约5min，苯胺蓝复染5min，0.2%冰醋酸处理1min，脱水后中性树胶封固。显微镜下观察胶原纤维呈蓝色，胞质、肌纤维和红细胞呈红色，胞核黑色。

1.2.6 蛋白质印迹检测 取大鼠阴道壁组织液氮研磨后加入蛋白裂解液，充分混匀后4℃、12 000转/min离心5min，取上清液，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测样品的蛋白浓度，加入适量5×蛋白上样缓冲液后煮沸8min使蛋白变性，使用8% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白样本，转膜，5%牛血清白蛋白封闭液室温封闭1h，加入一抗THBS1抗体（1∶3000）4℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液漂洗3遍，二抗室温孵育1h，再次用磷酸盐缓冲液漂洗3遍，使用ChemiDocTMTouch化学发光仪扫膜并分析条带。

1.3 统计学方法

应用GraphPad Prism 8.0和Image J 6.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验，并经Levene方差齐性检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠的造模情况

造模12周后，实验组大鼠子宫萎缩明显，体质量增加显著高于假手术组，雌二醇水平显著低于假手术组（P<0.01），见图1、表1。

表1 造模12周后两组大鼠的各项指标比较（±s）

表1 造模12周后两组大鼠的各项指标比较（±s）

组别 子宫重量（g）体质量增加（g）雌二醇（pg/ml）假手术组（n=12） 0.87±0.02 15.82±0.89 82.75±1.33实验组（n=12） 0.10±0.02 45.32±0.74 40.60±0.67 t 30.22 25.58 28.32 P <0.01 <0.01 <0.01

图1 两组大鼠的子宫对比

2.2 Masson染色结果

与假手术组比较，实验组大鼠的阴道壁上皮层明显萎缩，平滑肌束变薄，肌束间隙变宽，固有层和肌层中胶原纤维沉积增加，且排列分布杂乱、碎片化，见图2。

图2 两组大鼠的阴道壁胶原纤维形态结构（Masson染色，×200）

2.3 免疫组织化学染色结果

两组大鼠的阴道壁全层THBS1均有表达，以阴道壁固有层为主。与假手术组比较，实验组的棕黄色颗粒更粗大，含量更多，且分布更密集，彼此形成细密的网络结构，见图3。实验组大鼠阴道壁中THBS1表达显著高于假手术组（P<0.05），见图4。

图3 两组大鼠阴道壁中的THBS1表达（免疫组织化学染色，×200）

图4 两组大鼠阴道壁中的THBS1蛋白表达

3 讨论

随着预期寿命的延长及人口老龄化的进程，预计到2050年有临床症状的POP患病率将增加约50%[8]。由于对POP的具体发病机制了解有限，目前以手术为主的治疗方案侧重于恢复盆腔器官的正常解剖结构，忽视对盆底支持组织功能方面的治疗，可能导致患者出现排尿障碍等术后并发症，且术后复发率仍然很高，二次手术发生率高达19%[9-10]。为恢复患者盆底支持结构的生理功能，从根本上治愈患者及提供更精准的预防手段，对POP相关潜在靶点的深入研究具有重要临床意义。

阴道壁包括上皮层、富含胶原纤维的固有层、平滑肌束组成的肌层和外膜层，其中固有层和肌层在维持阴道壁的生物力学特性中发挥重大作用[11]。研究证实，绝经与POP患病风险增加存在直接关联。绝经后，血清雌激素水平及盆腔结缔组织中雌激素受体浓度显著降低，这种低水平雌激素的环境改变促使盆腔结缔组织中胶原纤维杂乱无序的沉积，进而导致支持功能下降[12-13]。

研究证实，在人体来源的子宫内膜基质细胞、垂体内皮细胞中雌激素治疗可抑制THBS1的表达[7,14]。在多囊卵巢综合征大鼠模型中也发现血清THBS1表达下降，这可能与雌激素水平升高有关[15]。此外，雌激素还可通过下调THBS1受体CD36，进而抑制THBS1与CD36结合后所激活的下游通路[16]。相反，在双侧卵巢切除术后大鼠的比目鱼肌中THBS1表达增加[17]。上述研究结果提示雌激素水平与THBS1表达呈负相关，本研究也发现双侧卵巢切除术后大鼠的血清雌激素水平明显下降，且阴道壁中THBS1表达上调，与预期结果一致。THBS1可激活转化生长因子β1，而转化生长因子β1的激活不仅加速成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，且诱导促纤维化基因转录增加，还会加剧炎症反应，最终导致组织广泛纤维化[18]。THBS1还可通过直接结合或间接作用来调控基质金属蛋白酶的活性，进而加剧细胞外基质的胶原沉积[19]。Lu等[20]研究发现THBS1是治疗糖尿病肾脏并发症的有效治疗靶点，在糖尿病小鼠模型中给予THBS1阻滞剂可选择性抑制肾脏中过量激活的转化生长因子β活性，进而缓解肾脏纤维化改变。Bao等[21]也证实THBS1介导的间歇性缺氧可诱导心肌成纤维细胞活化和心肌纤维化。因此，作为胶原纤维代谢的重要调节剂，THBS1有助于胶原纤维在细胞外基质中沉积。

本研究通过切除大鼠的双侧卵巢构建大鼠雌激素缺乏模型，12周后实验组大鼠的阴道壁中发生胶原纤维代谢异常的病理改变，阴道壁上皮层萎缩，排列紊乱且碎片化的胶原纤维沉积在黏膜层和肌层，导致阴道僵硬度增加，与POP患者阴道壁的病理学观察相一致[22]。推测实验组大鼠体内低雌激素环境使得阴道壁中THBS1表达增加，后者通过扰乱结缔组织中正常的胶原纤维代谢引起阴道壁过度纤维化，进而损害阴道壁的生物力学性质，导致其对POP的易感性增加。

综上，THBS1可能参与雌激素缺乏所诱导的阴道壁过度纤维化，从而导致盆底支持组织的强度及韧性受损，参与POP的发生发展。