民族药肺经草的质量标准研究

陈思羽，王越，林丽婷，文飞燕，裴瑾

肺经草始见于《天宝本草》，载：“肺经草即半边钱[1]。”经考证《天宝本草》中肺经草为伞形科Umbelliferae薄片变豆菜Sanicula lamelligeraHance的干燥全株[2]。肺经草在《中国民族药辞典》、《中国民族药志》、《中药大辞典》、《中华本草》、《四川省中药资源志要》等也均有记载。《中药大辞典》和《中华本草》记载为：大肺筋草为“伞形科变豆菜属Sanicula薄片变豆菜Sanicula lamelligeraHance和天蓝变豆菜Sanicula coerulescensFranchet[3,4]。”同时，《四川中药饮片炮制规范》1977年版和1984年版收载的“肺筋草”，均为伞形科植物薄片变豆菜干燥全株。生长在海拔500～2000m的阴湿山坡，沟边，路旁及林下的湿润砂质土壤，溪边湿地路旁竹林或阴湿杂木林下[5,6]。产于四川乐山、峨眉、都江堰、凉山州等地区。依据大量文献记载和实地调查发现，虽然四川省民间作肺经草使用的有变豆菜属6种2变种，但形成商品品种流通的仅有薄片变豆菜和天蓝变豆菜[7,8]，故将薄片变豆菜和天蓝变豆菜作为肺经草基原种。

肺经草中主要含黄酮、三萜皂苷、倍半萜类成分[9-13]，其中黄酮类成分可能与其化痰止咳，活血调经的药理作用有关。周小江对肺经草品质进行研究发现，肺经草的乙酸乙酯提取部位的主要成分为总黄酮成分，具有良好的祛痰作用[14,15]。有研究表明，肺经草中总黄酮成分具有一定的抑制流感病毒增殖的作用[16]，Liu[17]从肺经草中提取得到一个新的黄酮苷元—saniculamin C，对人胃癌细胞有强效抗增殖活性，具有较高的临床应用价值。同时，《天宝本草》记载：“肺经草即半边钱，专包脐风又化痰哮吼咳嗽，称第一，四时感冒，散风寒[18]。”《中国民族药辞典》记载：“全草治风湿疼痛；全草（炖肉）治瘦弱；全草（泡酒）治跌打损伤[19]。”所以本实验依据古籍和现代研究，拟将总黄酮作为质量标准控制物。

规范化的质量标准建立是肺经草现代化研究的重要内容，本研究按照《中国药典》2020年版中相关规定、参照药材质量标准的制定方法，对来自不同产地、基原的11批肺经草药材进行形态、性状、显微特征和薄层色谱鉴别，对其水分、灰分、浸出物等进行检查，并以总黄酮成分和黄酮类化合物槲皮素为指标建立提取和HPLC含量测定方法，以期建立肺经草药材规范化的质量标准，为其质量控制和临床应用提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

Ulti Mate 3000型高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher公司）KQ-600DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、SOP型电子分析天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）、DHG-9146A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）、ZF-90型紫外分析仪（温州奥利生物医学仪器厂）、HWS24型电子恒温水浴锅（上海一恒）、Spectra Max iD3型酶标仪（美谷分子仪器上海有限公司）、Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 250mm×150 mm，5μm（安捷伦科技中国有限公司）、DM2500型莱卡电子显微镜（青岛泰斯鼎科技有限公司）。

1.2 药物与试剂

芦丁对照品（纯度≥9 8%，批号M U S T-21101104，成都市科恩化学品有限公司），槲皮素对照品（纯度≥98%，批号MUST-21101104，成都市科恩化学品有限公司）；甲醇、甲酸、乙醇、甲苯、乙酸乙酯等为分析纯，均购于成都市科恩化学品有限公司。Silica gel 60型铝箔板（德国Merck公司）；Silica gel 60型高效硅胶薄层层析板（德国Merck公司）；硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂）。

11批肺经草药材由野外采集和药材市场购买，经由成都中医药大学中药资源教研室裴瑾教授鉴定为伞形科变豆菜属植物薄片变豆菜Sanicula lamelligeraHance和天蓝变豆菜Sanicula coerulescensFranchet的干燥全草。11批样品的详细信息（见表1）。

表1 肺经草样品采集信息表

2 方法

2.1 植物形态

薄片变豆菜Sanicula lamelligera Hance 多年生矮小草本，高15～50cm。全株无毛。根茎粗短，多数细长的侧根，棕褐色。茎3～17，直立，花葶状、上部分；基生叶叶柄长5～18cm，叶片椭圆形或心形，长2～6cm，宽3～9cm，掌状三裂，中裂片楔状倒卵形或椭圆状倒卵形至菱形，上部3浅裂，基部楔形、有短柄；最上部的茎生叶小，三裂至不分裂，裂片线状披针形，叶片背面有较明显的叶脉，淡紫红色或浅绿色，表面绿色。花序通常二至四回二歧分枝，叶缘有刺毛；花瓣白色。果实为双悬果，长卵形或卵形，长2.5mm，宽2mm，幼果表面有啮蚀状或微波状薄层，成熟后成短直皮刺、基部连成薄片；花、果期4～11月。

天蓝变豆菜Sanicula coerulescens Franch. 本品与薄片变豆菜的区别为：侧生的伞形花序无柄，花序呈假总状花序，萼齿线形或呈刺毛状。花、果期3～7月（见图1）。

图1 肺经草原植物图1-薄片变豆菜；2-天蓝变豆菜

2.2 药材性状鉴别

药材多皱缩成团，根茎短，须根多呈黑褐色。基生叶叶柄长至近20cm；叶片常破碎，完整者展平后呈心状卵形、圆心形或近五角形，长2～7cm，宽3～10cm，掌状三裂，叶缘具缺刻或圆锯齿；叶上表面灰绿色、黄绿色至黄褐色，下表面黄绿色、黄褐色或紫褐色，可见明显的紫褐色或深褐色的叶脉。带花者，伞形花序或呈假总状花序，细小。可见双悬果，球形、长卵形或卵形，长2～3mm，果实表面具短而直的皮刺。质脆易碎，气微，味淡，微苦。

天蓝变豆菜与薄片变豆菜的区别：侧生的伞形花序无柄，花序呈假总状花序；萼齿线形或呈刺毛状（见图2）。

图2 肺经草药材图1-薄片变豆菜；2-天蓝变豆菜

2.3 粉末显微特征鉴别

薄片变豆菜的粉末为灰黄绿色至灰褐色，气微，味淡，微苦。草酸钙簇晶，直径15～40µm，棱角多锐尖。淀粉粒单粒或多粒存在，椭圆形或圆形，直径5～10µm，复粒由2～4个分粒组成导管多为螺纹导管，少见网纹导管，长40～400µm，直径8～10µm。纤维成束存在，微木化或木化。木栓细胞淡黄色，长方形或类圆方形，排列紧密，垂周壁微波状增厚。表皮细胞垂周壁波状弯曲，气孔不定式或不等式。（见图3）

图3 肺经草粉末显微特征图1-簇晶；2-导管；3-纤维束；4-表皮细胞及气孔；5-木栓细胞

天蓝变豆菜粉末颜色、气味、显微特征与薄片变豆菜类似，只是在长度大小方面有差异，天蓝变豆菜导管长度平均值小于薄片变豆菜，簇晶虽有但数量不及薄片变豆菜。

2.4 薄层色谱鉴别

2.4.1 供试品溶液制备 取本品粉末1g，加80%甲醇50ml，加热回流1h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用乙醚萃取2次，每次20ml，弃去乙醚液，水液加乙酸乙酯振摇提取2次，每次20ml，弃去水液，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取肺经草对照药材粉末1g，同法制成对照药材溶液[20-23]。

2.4.2 薄层色谱条件及结果 照薄层色谱法（中国药典2020年版四部通则0502）试验，吸取供试品溶液5µl，分别点于同一硅胶G薄层板上。以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5:4:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3%三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在Rf值0.2～0.7范围内，应呈现1个浅蓝色主斑点（见图4）。

图4 肺经草样品TLC图

2.5 药材检查项

对药材进行常规检查可以有效评价药材的优劣。水分照《中国药典》2020年版水分测定法通则0832第二法测定[24]；总灰分和酸不溶性灰分照《中国药典》2020年版灰分测定法通则2302测定[25]；浸出物根据《中国药典》2020年版浸出物测定法通则2201项下的热浸法进行测定[26]。11批样品的水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物的测定结果（见表2）。根据测定结果，11批样品的水分在11.162%～13.178%，平均为12.056%；总灰分在13.932%～28.570%，平均为17.692%；酸不溶性灰分在1.063%～6.551%，平均为2.638%；水浸出物（热浸法）在15.707%～22.827%，平均为19.027%。

表2 肺经草样品检查项测定结果（n=3）

2.6 总黄酮含量测定

2.6.1 芦丁对照品溶液制备 精密称取芦丁对照品5mg，用50%乙醇定容溶解并定容至25ml，配成0.2mg·ml-1的芦丁标准溶液。

2.6.2 标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液1、2、3、4、5、6ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6.0ml，加5%亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6min，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15min，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法（2020年版《中国药典》四部，通则0401[27]），在500nm波长处测定吸光度。以浓度（X，mg·ml-1）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标绘制标准曲线。

2.6.3 供试品溶液制备和测定方法 取薄片变豆菜粉末（过三号筛）0.5g，采用超声提取的方法，选取体积分数为50%的乙醇溶液、料液比1:20（g·ml-1）、提取时间30min、超声功率（100W，100HZ），过滤，精密量取0.5ml滤液，置25ml容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀，即得。照“2.6.2”项下，自“加水至6ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读取供试品溶液中含芦丁的浓度（mg·ml-1），计算，即得[28,29]。

2.6.4 加样回收率试验 采用加样回收法，对已知浓度的药材粉末提取液6份，分别加入已知浓度50%的对照品溶液，按“2.6.3”项下方法制备供试品溶液，测定吸光度，计算回收率，计算得RSD为1.674%（n=6）（见表3）。

表3 肺经草样品加样回收率结果（n=6）

2.6.5 线性关系考察 以浓度（X，mg·ml-1）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标进行线性回归，得到回归方程Y =10.593X+0.0044（r=0.9991，n=6）。结果表明，芦丁对照品溶液质量浓度在0.0083～0.0495 mg·ml-1的范围内与吸光度线性关系良好。

2.6.6 测定结果 称取11批样品，按“2.6.3”项下方法制备供试品溶液，测定吸光度。11批样品的总黄酮含量测定结果（见表4）。根据测定结果，总黄酮含量在1.658%～6.598%之间，平均值为3.420%。

表4 肺经草样品总黄酮含量测定结果（n=3）

2.7 槲皮素含量测定

2.7.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18（250mm×150 mm，5μm）；流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50）；检测波长为360nm；流速1mL min-1；进样量：10µL；柱温：25℃。

2.7.2 对照品溶液制备 精密称取槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含10µg的溶液。

2.7.3 供试品溶液制备 精密称取药材粉末（过三号筛）约2g，置于250ml具塞锥形瓶中，精密加入50ml 80%甲醇，称定质量，加热回流1.5h，取出，放冷，80%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，加浓盐酸5ml，加热回流1.5h，放凉，转移至50ml量瓶中，加80%甲醇至刻度，摇匀，0.45µm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.7.4 系统适应性考察 取对照品、供试品溶液适量，在“2.7.1”项色谱条件下进样测定（见图5）。由此可知，各成分色谱峰周围无干扰峰，与其它峰完全分离（分离度＞1.5），理论塔板数以槲皮素计，不低于5000。

图5 对照品和肺经草供试样品HPLC图

2.7.5 线性关系考察 精密量取对照品溶液适量，逐级稀释，定容，制得6个质量浓度，在“2.7.1”项色谱条件下进样测定。以槲皮素峰面积（y）对样品浓度（x）进行线性回归，得回归方程：y=2.5097x-0.4215，R²=0.9929，表明槲皮素含量在1µg·ml-1～6µg·ml-1的范围内线性关系良好。

2.7.6 方法学考察 对该方法进行精密度、稳定性、重复性、加样回收率试验，发现所得结果均符合分析要求。

2.7.7 样品含量测定 取11批药材，按“2.7.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.7.1”项色谱条件下进样测定，计算含量结果（见表5）。根据测定结果，槲皮素含量在0.0000168～0.000104 mg·g-1之间。因其平均值含量小于千分之一，不纳入质量标准。

表5 供试品中槲皮素含量测定结果（¯x±SD, n = 3）

3 讨论

本文依据《中国药典》2020年版四部通则，分别从性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱鉴别对肺经草药材进行了定性鉴别，从水分、总灰分、酸不溶灰分、水热浸法对肺经草药材进行了检查，以芦丁为对照品进行了总黄酮含量测定，同时以槲皮素为对照品进行了HPLC含量测定，系统开展了肺经草的质量标准研究。通过研究发现，薄片变豆菜与天蓝变豆菜之间在根、茎、叶有极大的相似性，2者之间的区别为：薄片变豆菜花序为二歧分枝，天蓝变豆菜侧生的伞形花序无柄，花序呈假总状花序；萼齿线形或呈刺毛状。综合评价不同产地及批次的11批样品结果。

肺经草现主产于成都平原及周边地区，夏秋季节雨水较多，故应保持药材干燥，规定水分不得过14.000%。根据测定结果FJC-3的总灰分含量为28.570%，FJC-5的酸不溶灰分为6.551%，均高于平均值。查看原药材性状可知，市场购买的药材为直接采挖晒干，并未进行过任何清洗加工，所以含的泥沙较多；考虑此标准有着规范市场的作用，故规定总灰分不得过20.000%，酸不溶性灰分不得过4.000%。浸出物测定时，对冷浸法和热浸法进行考察，其中热浸法中以水为溶剂含量最高，这也与民间民族常用用法水煎煮相吻合，因此拟定浸出物含量不得少于15.000%。总黄酮与肺经草的药效息息相关，根据测定的数据，拟定总黄酮含量以芦丁（C27H30O16）计，不得少于2.000%，但由于槲皮素含量较少，作者不建议将槲皮素作为质量标志控制物。因此，确定肺经草药用基原植物为伞形科变豆菜属薄片变豆菜Sanicula lamelligeraHance和天蓝变豆菜Sanicula coerulescensFranchet的干燥全草。

本实验采取的方法经过多次筛选获得。薄层色谱鉴别比较了甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5:5:1、5:4:1、5:3:1）、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸-水（6:12:5:2）等展开系统，经过反复试验，确定甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5:4:1）为展开系统，最终得到的薄层色谱斑点分离度较好，还增加了2种基原的对照药材，提高了TLC法的专属性。同时比较了不同厂家，不同类型的薄层色谱板和铝箔板并进行耐用性考察，结果均表明本方法的专属性和耐用性良好。本实验在对肺经草总黄酮含量进行测定时，考察了三种因素—乙醇体积分数、液料比和提取时间对其提取率的影响，设置乙醇体积分数：50、60、70、80、90%；料液比：1:20、1:30、1:40、1:50、1:60；提取时间：30、45、60、75、90min。最终确定肺经草总黄酮提取料液比为20:1，乙醇浓度为50%，提取时间为30min。

本研究为四川省药品监督管理局《四川省民族药材标准》品种质量标准制定科研项目内容之一，综合评价不同产地及批次的11批样品结果。根据研究结果拟定了肺经草质量控制指标，填补了肺经草作为药材入药无相关质量标准的空白，区别于现行药典日渐提高精细化的标准制定方向，本标准是实用性和适用性兼备的实用标准，落地可实施，能很好地规范市场，同时也为肺经草资源的进一步综合利用与开发奠定基础。