基于GC-MS技术的圆柏挥发性成分分析及不同品种比较研究

陈玉兰，赵程成，罗玉婷，范 刚

圆柏为藏医常用药材，始载于藏医经典著作《四部医典》[1]，具有清热、消炎、干黄水等功效，常用于治疗肾炎、关节炎等疾病。圆柏临床应用广泛，可与多种藏药配伍，在十味诃子丸、二十五味獐牙菜丸、茜草丸等复方中均有使用[2-3]。圆柏具有明显且独特的香味，现代研究表明，圆柏药材的挥性油含量丰富，其中主要成分为萜类及其含氧衍生物，如榄香醇、柏木脑等，这些成分具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等良好的药理活性[4-6]。

圆柏为典型的多基原药材。课题组前期调查发现[7]，目前市场流通及临床使用较多的品种主要为香柏S.pingiivar.Wilsonii、滇藏方枝柏S.wallichiana、高山柏S.squamata、大果圆柏S.tibetica、祁连圆柏S.przewalskii。目前，关于圆柏药材的挥发油分析均为单一品种研究。如刘喜梅[5]分析了不同地区、不同海拔祁连圆柏的挥发性成分。涂永勤[6]等和董艳芳[8]等发现香柏挥发油中α-蒎烯等成分的含量较高。这些研究对于圆柏药材的质量控制具有一定的意义，但圆柏不同品种药材之间的挥发性成分种类和含量是否存在差异尚不明确。本研究采用GC-MS联用技术对不同基原圆柏中挥发性成分进行定性分析，并利用主成分分析（PCA）、偏最小二乘法（PLS-DA）和方差分析，寻找种间差异成分，进行质量评价，研究结果可为圆柏药材的质量控制和临床应用提供参考依据。

1 仪器与材料

美国安捷伦7890A-5975C气相色谱仪质谱仪，色谱柱：Agilent HP-5MS毛细管色谱柱（30 mm × 250 μm × 0.25 μm），Sartorius BP121s 型电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司)。本研究共收集47批不同品种的圆柏药材样品，经重庆市中药研究院秦松云教授鉴定为滇藏方枝柏S.wallichiana、高山柏S.squamata、香柏S.pingiivar.wilsonii、大果圆柏S.tibetica和祁连圆柏S.przewalskii。详细信息见表1

表1 圆柏样品来源一览表Table 1 Summary table of Sabinae Ramulus sample sources

XB-05 香柏S. pingii var. wilsonii 西藏农业农村部农产品质量监督检验测试中心5.01 XB-06 香柏S. pingii var. wilsonii 西藏藏医药大学附属医院 4.29 XB-07 香柏S. pingii var. wilsonii 西藏国际藏中药材交易城 4.13 XB-08 香柏S. pingii var. wilsonii 青海省果洛州藏医医院4.26 XB-09 香柏S. pingii var. wilsonii青海省称多县藏医院4.96 XB-10 香柏S. pingii var. wilsonii 四川省甘孜藏族自治州康定市康定机场3.95 XB-11 香柏S. pingii var. wilsonii 四川省甘孜藏族自治州康定市加呷腊2.53 XB-12 香柏S. pingii var. wilsonii 西藏自治区昌都地区芒康县加尼顶乡3.33 DZ-01 滇藏方枝柏S. wallichiana 四川省德格县柯洛洞乡1.91 DZ-02 滇藏方枝柏S. wallichiana 四川省甘孜州理塘县兔儿山1.90 DZ-03 滇藏方枝柏S. wallichiana 西藏国际藏中药材交易城 1.88 DZ-04 滇藏方枝柏S. wallichiana 西藏自治区林芝市藏医院（察隅）4.50 DZ-05 滇藏方枝柏S. wallichiana 西藏自治区林芝县林芝镇 4.91 DZ-06 滇藏方枝柏S. wallichiana西藏自治区山南地区5.89 DZ-07 滇藏方枝柏S. wallichiana 四川省甘孜州道孚县孔色乡9.90 DZ-08 滇藏方枝柏S. wallichiana 四川省得荣县中藏医院3.98 DZ-09 滇藏方枝柏S. wallichiana 云南省德钦县白马雪山4.32 DZ-10 滇藏方枝柏S. wallichiana 云南省迪庆州德钦县升平镇3.53 DZ-11 滇藏方枝柏S. wallichiana 西藏睿俊芳生物科技发展有限责任公司3.94 DZ-12 滇藏方枝柏S. wallichiana 西藏自治区林芝市林芝县鲁朗镇4.67 GS-01高山柏S. squamata青海省海南州贵南县1.91 GS-02高山柏S. squamata四川省甘孜州德格县藏医院1.90 GS-03高山柏S. squamata青海省海东市互助土族自治县1.91 GS-04高山柏S. squamata青海省藏医院1.94 GS-05高山柏S. squamata成都国际贸易城中药材市场 (6-1-1158)3.93 GS-06高山柏S. squamata青海省海南州藏医院3.91 GS-07高山柏S. squamata青海省黄南州泽库县藏医院3.93 GS-08高山柏S. squamata青海省药材市场（三智） 3.88 GS-09高山柏S. squamata四川省康定市折多山4.16 GS-10高山柏S. squamata云南省德钦县白马雪山2.36 GS-11高山柏S. squamata四川省康定市高尔寺山3.70 DG-01大果圆柏S. tibetica西藏自治区那曲地区藏药厂3.73

DG-02大果圆柏S. tibetica西藏自治区山南地区3.97 DG-03大果圆柏S. tibetica成都国际贸易城中药材市场（6-1-0725）3.96 DG-04大果圆柏S. tibetica青海省称多县藏医院4.17 DG-05大果圆柏S. tibetica西藏自治区山南地区5.91 DG-06大果圆柏S. tibetica西藏藏医学院藏药有限公司2.99

2 方法

2.1 圆柏挥发油的提取

取药材粉末（过三号筛）5 g，按《中国药典》2020版第四部通则2204挥发油测定法甲法提取挥发油，连续回流5.0 h，至油量不再增加为止，停止加热，冷却，收集挥发油，加入少许无水硫酸钠对挥发油进行干燥，并用正己烷稀释至一定的浓度，用微孔滤膜过滤，备用。

2.2 GC-MS测定条件

色谱条件：Agilent HP-5MS毛细管色谱柱（30 mm × 250 μm × 0.25 μm），载气为氦气；程序升温：初始温度50 ℃，保持1 min，然后以5 ℃/min升温至135 ℃保持0 min，最后以8 ℃/min升至250 ℃，维持10 min。

质谱条件：离子源EI，质量扫描范围（m/z）：15～350，离子源温度200 ℃，四级杆温度150 ℃，溶剂延迟3 min，采集模式为全扫描。

2.3 挥发性成分的鉴定和统计分析

利用质谱库 NIST14分析圆柏中的挥发性化合物，通过查询CAS号及相关参考文献进行解析，对挥发性成分中检测到的化合物定性，采用SIMCA-P 14.1软件进行PCA、PLS-DA分析，并采用GraphPad Prism 5.0软件进行方差分析。

3 结果与分析

3.1 不同品种圆柏药材的挥发油含量及挥发性成分测定结果

47批圆柏药材的挥发油含量在1.85%～9.90%（ml/g）之间，平均值为3.75%，详见表1。采用GC-MS技术从圆柏挥发性成分中共鉴定了66个化合物，祁连圆柏、香柏、滇藏方枝柏、高山柏、大果圆柏中鉴定化合物的数量分别为：53个、62个、61个、55个和54个，所鉴定的化合物主要为萜类、酯类、醇类、酮类。榄香醇为各品种均含有且平均含量最高的化合物，含量范围为3.21%～36.1%，平均含量为17.43%。此外，柏木脑、γ桉叶醇、α-桉叶醇、泪杉醇、β-桉叶醇、十氢-2,7,3,6-二甲烷萘、δ-杜松烯、α-毕橙茄醇、13-表泪杉醇、(4R)-松香-7,13-二烯-18-醛为圆柏挥发油中含量较高的成分，详见表2。

表2 圆柏的挥发性成分分析结果Table 2 Results of volatile composition analysis of Sabinae Ramulus

Ybh-17月桂酸0.06 0.51 0.33 0.44 0.22 0.31 Ybh-18海松-8(14),15-二烯0.08 0.02 0.08 0.02 0.04 0.05 Ybh-19枞醇0.03 1.07 1.31 0.13 0.66 0.64 Ybh-20(+)-γ-Eudesmol0.22 0.16 0.27 0.05 0.29 0.20 Ybh-21palustral0.08 0.65 0.50 0.02 0.35 0.32 Ybh-22正二十一烷- 0.03 0.44 1.29 0.41 0.43 Ybh-23肉豆蔻酸0.11 0.27 0.09 0.15 0.11 0.15 Ybh-24罗汉柏烯1.12 0.82 0.34 0.28 0.98 0.71 Ybh-25(4aS,4bS,10aS)-1,1,4a-三甲基-7-丙-2-基-2,3,4,4b,5,9,10,10a-八氢菲- 0.14 0.22 - 0.05 0.08 Ybh-26(4R)-松香-7,13-二烯-18-醛0.53 2.89 1.81 - 1.48 1.34 Ybh-27γ-榄香烯0.31 0.16 0.47 0.10 0.86 0.38 Ybh-28 (4aS,4bS,10aS)-1,2,3,4,4a,4b,5,6,7,9,10,10a-十二氢-1,1,4a-三甲基-7-(1-甲基亚乙基)-菲0.02 0.11 0.25 - 0.08 0.09 Ybh-29正二十五烷0.18 0.33 0.09 0.41 0.04 0.21 Ybh-30a-桉叶醇3.56 3.85 - 7.18 8.91 4.70 Ybh-31(1E,6E,8S)-1-甲基-5-亚甲基-8-(1-甲基乙基)-1,6-环癸二烯0.47 0.08 0.08 - 0.40 0.21 Ybh-32二十烷0.25 0.10 0.10 0.26 0.34 0.21 Ybh-33 (1S，4S,4aR)-1,2,3,4,4a,5,6,7-八氢-4-甲基-7-亚甲基-1-(1-甲基乙基)-萘0.02 0.08 0.12 0.28 0.02 0.10 Ybh-34依兰油烯0.13 0.06 0.05 0.03 0.06 0.07 Ybh-35 (4aR,4bS,10aR)-1,2,3,4,4a,4b,5,9,10,10a-十氢-1,4a-二甲基-7-(1-甲基乙基)-1-菲甲醛0.06 0.30 0.30 - 0.12 0.15 Ybh-3613-表泪杉醇1.38 2.44 1.68 0.60 0.74 1.37 Ybh-37(1R，4aR，4bS，7R，10aR)-1,4a，7-三甲基-7-乙烯基-1,2,3,4,4a，4b,5,6,7,9,10,10a-十二烷基氢菲-1-甲醛0.05 0.18 0.30 - 0.09 0.12 Ybh-38α-石竹烯0.07 0.09 0.02 0.03 0.03 0.05 Ybh-392-十三烷酮0.31 - 0.02 0.44 - 0.15 Ybh-40阿尔法姜黄烯0.06 0.23 0.05 0.02 0.03 0.08 Ybh-41正二十六烷0.08 0.11 0.11 0.31 0.22 0.17 Ybh-42T-杜松醇0.88 0.84 1.01 0.62 - 0.67 Ybh-43十二甲基环六硅氧烷0.02 0.01 0.04 0.06 0.02 0.03 Ybh-44十八烷0.12 0.10 0.02 0.38 - 0.12 Ybh-45棕榈酸0.02 0.05 0.42 0.17 - 0.13 Ybh-464,7-二甲基-1-丙烷-2-基-1,2,3,4,5,6-六氢萘- 0.02 2.89 0.11 0.02 0.61 Ybh-47十氢-2,7,3,6-二甲烷萘8.09 4.14 1.55 - - 2.76 Ybh-48α-毕橙茄醇2.48 2.69 0.06 0.64 1.60 1.49 Ybh-491,2,4a,5,6,8a-六氢-4,7-二甲基-1-(1-甲基乙基)萘0.11 0.21 0.10 0.07 0.75 0.25 Ybh-50((1S，4aR，4bR，10aR)-7-异丙基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,4b,5,6,10,10,10a-十氢菲蒽-1-基)甲醇- 0.08 0.08 - 0.05 0.04 Ybh-51十八甲基环九硅氧烷0.03 0.02 0.02 0.17 0.06 0.06 Ybh-52柳杉二醇- 0.09 4.72 - 0.02 0.97 Ybh-53β-桉叶醇- 4.64 0.01 2.58 - 1.45 Ybh-54植物醇- 0.02 0.10 0.09 - 0.04

Ybh-55十四甲基环七硅氧烷0.05 0.04 0.02 0.06 0.11 0.06 Ybh-56大根香叶烯D0.15 0.03 0.14 0.08 0.04 0.09 Ybh-57(1R,4aR,4bS,10aR)-1,4a-二甲基-7-丙-2-亚基-3,4,4b,5,6,9,10,10a-八氢-2H-菲-1-甲醛- 0.06 0.02 0.06 0.02 0.03 Ybh-58(-)-氧化石竹烯- 0.02 0.31 0.18 - 0.10 Ybh-59(1S,4S,4aS)-1-异丙基-4,7-二甲基-1,2,3,4,4a,,5-六氢萘- 0.06 - 0.08 - 0.03 Ybh-60(-)-异喇叭烯0.07 0.07 - 0.06 - 0.04 Ybh-611-表三苯酚- - 0.87 0.43 - 0.26 Ybh-62正二十八烷0.05 0.07 0.03 1.06 1.22 0.49 Ybh-631,2,3,4,4a,7-六氢-1,6-二甲基-4-(1-甲基乙基)-萘0.02 0.04 0.04 - 0.02 0.02 Ybh-64香茅醇0.05 - - 0.10 - 0.03 Ybh-65α-可可烯- - 0.06 0.02 0.05 0.02 Ybh-66γ-马阿里烯- 0.26 - - 0.04 0.06

3.2 圆柏不同基原药材的化学计量学分析

3.2.1 PCA和PLS-DA分析 采用SIMCA-P软件对所有挥发性成分（47个样品×66个变量）进行无监督的PCA分析，绘制得分散点图（图1）。结果显示，圆柏5个品种的分离效果不佳，大部分样品重叠。为了突出种间差异，进一步进行有监督的PLS-DA分析。从PLS-DA得分图（图2）可知，高山柏和香柏与其它3个品种有较好的分离，而大果圆柏、滇藏方枝柏与祁连圆柏三者大部分样品重叠，无法区分。这些结果表明，高山柏和香柏与其它3个品种的挥发性成分可能存在差异。此外，根据变量重要性图(VIP)找出对组间差异贡献较大的变量，并以VIP ＞ 1筛选不同基原圆柏药材的主要差异成分，结果共找到32个潜在的种间差异成分，见图3。

图1 圆柏药材的PCA得分图Fig. 1 Score plot of PCA of Sabine Ramulus

图2 圆柏药材的PLS-DA得分图Fig. 2 Score plot of PLS-DA of Sabine Ramulus

图3 圆柏挥发性成分PLS-DA变量权重VIP图Fig. 3 Variable importance plot of PLS-DA of Sabine Ramulus

3.2.2 方差分析 为验证PLS-DA所获取的分析结果，采用GraphPad Prism 5.0软件对圆柏药材的潜在种间差异成分、挥发油含量、种间差异成分的总含量进行单因素方差分析和Tukey’s多重比较检验，P＜ 0.05表示差异显著。结果表明（图4），圆柏不同品种间的挥发油含量不存在显著性差异，但柳杉二醇、泪杉醇、2-十三烷酮等14个化合物在种间存在明显的差异，为圆柏药材的主要种间差异标志物（makers）。此外，本研究进一步以这14个makers的总含量为指标进行圆柏不同基原药材的质量评价，结果表明，高山柏药材的总含量最低，说明其药材质量可能低于其它四种药材。

图4 圆柏种间差异成分、挥发油含量及种间差异成分总含量的方差分析结果（*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001）Fig. 4 Variance analysis results of the content of the different components,volatile oil and the total contents of the different components among species

4 讨论

本研究采用GC-MS技术从圆柏挥发性成分中共鉴定出66个化合物，其中榄香醇、柏木脑、γ桉叶醇、α-桉叶醇、泪杉醇、β-桉叶醇、十氢-2,7,3,6-二甲烷萘、δ-杜松烯、α-毕橙茄醇、13-表泪杉醇等为不同基原圆柏挥发油中共有且含量较高的成分。圆柏挥发性成分中富含萜类、倍半萜烯醇类化合物，提示其具有较强的抗菌作用[9]。现代研究发现，柏木脑[10-11]对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄杆菌、伤寒沙门氏菌、烟曲霉菌均有良好的抗菌活性。

此外，结合PCA、PLS-DA及方差分析，本研究首次揭示了圆柏不同品种之间挥发性成分的差异，最终确定泪杉醇、α-桉叶醇等14个化合物为圆柏药材的种间差异成分。据研究报道，泪杉醇具有抗遗传毒性、抗氧化等药理作用[12-13]；β-榄香烯及其衍生物具有抗肿瘤活性[14]，提示β-榄香烯含氧衍生物榄香醇可能具有抗肿瘤作用；α-桉叶醇具有抗神经源性炎症、抗肿瘤等作用[15-16]，对脑缺血损伤也具有保护作用[17]。这些化合物的生物活性与圆柏的功能主治有一定的相关性。因此，本研究进一步以这14个种间差异成分为指标对圆柏不同基原药材进行质量评价，结果大果圆柏、香柏、滇藏方枝柏和祁连圆柏无明显差异，但高山柏的质量可能较差，今后在临床使用中应注意区分。本研究从挥发性成分的角度探讨了圆柏不同基原药材的质量差异，今后应结合药理活性进行多维评价，从而为圆柏药材的质量控制和临床合理应用提供参考依据。