基于多元仪器分析结合化学计量法的不同产地胡椒油树脂品质比较

李 彤，王雨行，王向红，张玉涵，米 思,

（1.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071000；2.晨光生物科技集团股份有限公司，河北 邯郸 057250；3.河北省植物天然色素产业技术研究院，河北 邯郸 057250）

胡椒（Piper nigrumL.）是胡椒科胡椒属植物，主要种植于越南、印度尼西亚等热带地区[1]，因其具有刺激性辣味和强烈的芳香味被许多国家用作食品加工中的香料[2]。此外，胡椒果实中含有多种生物活性成分，使其具有抗癌和免疫调节等作用，因此也被用于医学研究[3]。胡椒油树脂是以胡椒为原料通过有机试剂、超临界流体等提取浸提生产而成，保留了胡椒原料原有的辛辣风味和营养价值。因此，胡椒油树脂正逐渐替代胡椒粒或胡椒粉在食品香料中的地位。

已有研究表明，产地是影响包括胡椒在内的食品香料品质的重要因素之一[4-5]，Campmajo等[6]借助高效液相色谱技术实现了对不同欧洲产地辣椒的判别分析；Feng Xiya等[7]利用气相色谱-离子迁移谱（gas chromatographyion mobility spectroscopy，GC-IMS）和气相色谱-质谱联用技术分析不同产地花椒中的挥发性有机物的差异。近年来针对不同产地胡椒样品的品质分析比较也有报道。张玉涵等[8]利用超快速气相电子鼻技术比较了不同国家胡椒及其提取物的成分组成差异；Tokalioglu[9]、Potorti等[10]利用电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）手段评估了不同产地多种香料中化学元素组成的异同点。

胡椒油树脂在我国乃至世界香辛料产业中占有越来越重要的地位。我国是胡椒消费大国，目前胡椒产量尚不能满足国内市场需求，胡椒原料多是从越南、印度尼西亚等东南亚国家进口。明确不同产地胡椒油树脂的品质特征与差异对后续产品开发具有重要意义。因此，本研究以产自越南、印度尼西亚、斯里兰卡的胡椒油树脂为研究对象，采用包括高效液相色谱、ICP-MS、GC-IMS在内的多元仪器分析手段，结合方差分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）法分析不同产地胡椒油树脂样品中胡椒碱类化合物、化学元素以及挥发性风味化合物组成及含量，并识别对产地判别具有重要贡献的化学标志物，确定胡椒油树脂的优势产区，旨在为不同产地的胡椒油树脂的品质辨别与选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

胡椒油树脂由晨光生物科技集团提供，来源于印度尼西亚、斯里兰卡和越南3 个产地，样品命名：印尼1、印尼2、兰卡1、兰卡2、越南1、越南2。胡椒油树脂样品置于4 ℃冰箱保存，待测。

甲醇（色谱纯）赛默飞世尔科技（中国）有限公司；胡椒碱标准品（纯度≥98%）、荜茇酰胺标准品（纯度≥98%）北京索莱宝科技有限公司；胡椒酸标准品（纯度≥98%）北京喀斯玛惠通科技有限公司；胡椒醇标准品（纯度≥98%）上海麦克林生物科技有限公司；2-甲基-3-庚酮对照品（纯度＞99%）德国Dr.Ehrenstorfer公司；其余有机试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

1525型高效液相色谱仪 美国Waters公司；FlavourSpec®GC-IMS联用仪 德国G.A.S公司；CEM MARS 5型密闭微波消解仪 美国CEM公司；7700X型ICP-MS仪 美国安捷伦科技公司。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色谱分析

标准品制备：称取胡椒碱、胡椒酸、胡椒醇和荜茇酰胺标准品5.0 mg，分别用无水乙醇溶解并定容至5 mL作为母液，将母液梯度稀释成100、62.5、50、25、12.5、5 mg/L的标准溶液，备用。

样品制备：称取0.050 g的胡椒油树脂，用无水乙醇定容至5 mL，避光超声提取30 min，提取液用0.22 μm的有机滤膜过滤待测。

胡椒碱和胡椒酸分析的色谱条件：Waters Diamonsil C18型色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（77∶23，V/V）；流速1.0 mL/min；检测波长为343 nm（胡椒碱）和254 nm（胡椒酸）；柱温30 ℃；进样量20 μL。

胡椒醇和荜茇酰胺分析的色谱条件：流动相为甲醇-水（60∶40，V/V）；检测波长为285 nm，其余均与胡椒碱的检测条件一致。

1.3.2 ICP-MS

微波消解条件：称取0.250 g胡椒油树脂，置于PTFE消解管中，加入6 mL 65%的浓硝酸溶液进行预消解。1 h后，加入2 mL 30%的H2O2溶液，混匀后于微波消解仪中进行消解。微波消解仪温度在8 min内升至120 ℃，保持2 min；然后以8 ℃/min的速率升至160 ℃，并且保持5 min，再以4 ℃/min的速率升至180 ℃，保持15 min。消解后冷却至室温，用去离子水（＞18.2 MΩ）洗出样品，定容至100 g，备用。

ICP-MS条件：射频功率1 280 W；雾化室温度2 ℃；载气流速1.0 L/min；蠕动泵流速0.5 mL/min；氧化物指标0.45%；双电荷指标1.01%。以Ge、In、Bi为所选内标，当内标元素的相对标准偏差（3 次重复测定）＞10%，需重新测定样品。

1.3.3 GC-IMS分析

样品前处理条件：准确称取2.500 g胡椒油树脂置于20 mL顶空瓶中，加入100 μL 0.2 mg/mL的2-甲基-3-庚酮溶液，振荡摇匀后备用。

自动进样条件：孵育温度40 ℃，孵化转数500 r/min，孵育时间10 min，采用顶空自动进样方式，进样量1 mL，进样针温度85 ℃，不分流模式进样。

GC条件：采用MXT-5色谱柱（15 m×0.53 mm，1 μm），柱温60 ℃，载气为氮气（≥99.999%）。

IMS条件：温度45 ℃，分析时间30 min，载气/漂移气为氮气（≥99.999%）；载气的流速程序为0～2 min，2 mL/min；2～10 min，2～15 mL/min；10～25 min，15～100 mL/min；25～30 min，100 mL/min。

数据处理条件：采用GC-IMS仪器配套的VOCal软件（内置NIST数据库和IMS数据库）对不同产地胡椒油树脂样品中的风味化合物进行定性分析，利用Reporter和Gallery Plot插件对比风味指纹图谱的差异。

1.4 统计分析

2 结果与分析

2.1 不同产地胡椒油树脂胡椒碱类化合物组成分析

本研究测定胡椒碱、胡椒酸、胡椒醇和荜茇酰胺4 种化合物在胡椒油树脂样品中的含量，分析结果见表1。其中胡椒碱在胡椒油树脂样品中的质量分数最高（25.83%～31.57%），这与刘红等[2]的研究一致。胡椒酸、胡椒醇和荜茇酰胺质量分数相对较少，且4 种化合物含量在不同产地胡椒油树脂样品中均存在显著差异（P＜0.05）。

表1 不同产地胡椒油树脂样品中胡椒碱及其类似物含量Table 1 Contents of piperine and related compounds in pepper oleoresin samples

胡椒碱是胡椒油树脂中存在的特征辣味成分，质量分数越高产生的刺激感越强[11]。兰卡2中胡椒碱的质量分数（31.57%）显著高于其他产地样品，越南产地胡椒碱质量分数整体偏低（表1）。该结果与Rivera-perez等[12]的研究类似。已有研究表明，胡椒酸、胡椒醇和荜茇酰胺等化合物的存在会对胡椒油树脂的风味品质产生影响。胡椒酸是一种芳香酸[13]，其在兰卡2中的质量分数（0.72%）显著高于其他样品。胡椒醇和荜茇酰胺化合物在印尼1样品中的质量分数最高，分别为1.88%和1.89%（表1）。综上，不同产地胡椒油树脂样品中胡椒碱类化合物的质量分数存在显著差异，越南产地的胡椒油树脂样品中4 种化合物的质量分数适中，因此具有更加适中的口尝辣感。产地是影响胡椒油树脂辛辣成分组成的重要因素之一，这种差异可归因于植物生长的土壤、水质、气候条件等[14-16]。

2.2 不同产地胡椒油树脂化学元素组成分析

本研究同时测定54 种化学元素在不同产地胡椒油树脂样品中的含量，其中Sc、Se、Y、Rh、Pd、Tb、Lu、Th 8 种元素在各样品中均未检测到，其余46 种元素测定结果见表2。K、P、Na、Cu、Mg、Fe、Al、Ca是胡椒油树脂样品中含量较丰富的元素，这与陈福北等[17]研究结果相似。统计分析结果表明，Mo、Ru、Ce、Pr、Nd、Eu、Na、Mg、P、K、V、Cr、Mn、Fe、Co、Cu、As、Rb、Ag、Sn、Cs、Ba、La 23 种元素含量在不同样品间存在显著差异（P＜0.05）。其中，Mg、Ba、V、Ce、La、Nd、Pr、Eu 8 种元素在兰卡2中含量最高；Fe、Sn、Cr、Mn、Co、As、Ag 7 种元素在印尼1中含量最高；K、P、Na、Rb、Ru 5 种元素在越南2中含量最高；Cs在印尼2中含量最高；Cu、Mo在越南1中含量最高（表2）。此外，Cd、As、Pb等重金属元素均未超出GB 2762—2017《食品中污染物限量》规定的标准。

进一步针对46 种化学元素进行多元数据统计分析。图1a为46 种化学元素分析的PCA得分图，PC1的方差贡献率为31.63%，PC2的贡献率为18.38%，累计贡献率达50.01%，可以反映出大部分化学元素含量信息，样品间分离程度好，表明各样品的化学元素组成存在明显差异。

图1 化学元素的PCA（a）、PLS-DA（b）和VIP（c）得分图Fig.1 PCA score plot (a),PLS-DA score plot (b) and VIP score plot (c) of chemical elements

2.3 不同产地胡椒油树脂挥发性风味化合物组成分析

采用GC-IMS法对不同产地胡椒油树脂风味化合物组成进行分析检测，结果见图2。受试样品中共检测出90 种挥发性风味化合物，包括醛类18 种、醇类17 种、酮类14 种、酯类13 种、烯烃类7 种、酸类3 种、醚类3 种、胺类3 种、呋喃类2 种、噻唑类2 种、吡嗪类2 种、芳香烃类1 种、烷烃类1 种、其他化合物4 种（表3）。统计分析结果表明，除2-癸烯醛、二乙醇缩乙醛、壬醛、顺式-3-辛烯醇、乙醇、3-辛醇、甲基庚基甲酮、丁酸乙酯、丙酸己酯、己酸丙酯、4-三氟甲基苯腈外，其余79 种化合物含量在不同产地胡椒油树脂样品中均存在显著差异（P＜0.05）（表3）。由挥发性风味化合物指纹图谱（图2）可知，越南两样品风味化合物组成较相似；除A框中化合物在兰卡2中信号强度较高外，其他化合物在印尼2、兰卡1、兰卡2中的含量接近；B框中的化合物在印尼1中的含量明显高于其他样品。

图2 挥发性风味化合物指纹图谱Fig.2 Volatile fingerprint of pepper oleoresin samples

表3 不同产地胡椒油树脂样品中挥发性风味化合物组成及含量Table 3 Composition and content of volatile flavor compounds in pepper oleoresin samples

PCA结果（图3a）表明，PC1、PC2方差贡献率分别为35.71%、27.80%，累计贡献率达63.51%。PC1中印尼2、兰卡1、兰卡2聚集度较高，越南1和越南2样品较接近，样品越聚集表明挥发性风味化合物组成越相似[24]；PC2中印尼1与其他5 种样品可明显区分。以上PCA结果与指纹图谱反映出的结果对应。

图3 挥发性风味化合物PCA（a）、PLS-DA（b）和VIP（c）得分图Fig.3 PCA score plot (a),PLS-DA score plot (b) and VIP score plot (c) of volatile flavor compounds

前期文献报道指出，烯烃类化合物，例如2-蒎烯、柠檬烯、石竹烯等，是胡椒油树脂中的特征香气成分[3,8,26]。经分析发现，烯烃类化合物在越南1样品中总体含量相对较高，其中2-蒎烯多存在于天然精油中[25]，含量最大（14.31 μg/g）；柠檬烯含量为4.46 μg/g，可赋予胡椒油树脂柑橘香气[27]；石竹烯含量为6.51 μg/g，赋予胡椒油树脂木质香气。除烯烃类特征香气化合物之外，越南1样品中还含有相对丰富的醛类、酮类、酸类化合物（表3）。醛类化合物阈值较低，对胡椒油树脂风味品质影响较大，尤其是2-十一烯醛、反式-2-己烯醛等含量较高的化合物，能够赋予胡椒油树脂样品草香味[28]。4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)呋喃酮、甲基环戊烯醇酮等酮类化合物可作为杂环化合物的中间产物，间接反映香气的贡献[29]。此外，4-戊烯酸、正己酸等酸类化合物在越南1样品中含量最高，主要赋予胡椒油树脂焦糖香气。以上分析结果表明，越南1胡椒油树脂在风味化合物组成及丰度方面优于其他产地样品，风味浓郁，品质较优。

3 结论

本研究综合分析比较印度尼西亚、越南、斯里兰卡3 个产地胡椒油树脂的胡椒碱类化合物、化学元素、挥发性风味化合物的组成及含量。结果表明，斯里兰卡产地样品中胡椒碱类化合物质量分数最高，越南产地样品中胡椒碱类化合物质量分数较低。借助ICP-MS手段同时测定胡椒油树脂样品中54 种化学元素的含量，元素丰度按照越南＞印尼＞兰卡顺序递减，结合多元变量统计分析，筛选出Cs、Na、Cu、Rb、Ru、P、Mg、Sn、Ag、K、Mo、Cr、Co 13 种元素作为判别元素。利用GC-IMS技术鉴定出90 种挥发性风味化合物，结合多元变量统计分析筛选出27 种具有判别意义的风味标志物，越南产地的胡椒油树脂风味化合物含量显著优于其他产地样品，风味较浓郁。综上所述，产地是影响胡椒油树脂化学组成的重要因素，相对而言越南产地的胡椒油树脂辣感适中、化学元素含量最高、风味最浓郁，品质明显优于其他3 个产地。本研究借助多元仪器分析结合化学计量法构建了印度尼西亚、越南、斯里兰卡产地胡椒油树脂的化学指纹图谱，明确了不同产地样品的品质差异，为胡椒油树脂的精深加工和产品开发提供数据支撑。