大肠埃希菌对细粒棘球蚴活性影响的体外研究

苗章　程萧　满洋　林芷伊　吴向未　伍希雅　蔡克丰　崔杰　张宏伟

摘要：目的 研究細粒棘球蚴与大肠埃希菌体外共培养的条件下活性、形态的变化，以及部分参与通路。研究细粒棘球蚴与特定浓度大肠埃希菌体外共培养的条件下活性、形态随时间的变化，以及部分参与通路。方法 将羊源性原头蚴重悬计数，分为空白组、0.5麦氏浓度大肠埃希菌组（实验组），并以12、24、48、72、96 h为时间节点，使用0.1％伊红染液按照体积1∶1的比例染色2 min后显微镜下观察并计算两组原头蚴的存活率；使用活性氧试剂盒在上述时间点检测两组原头蚴体内ROS水平；在12、48、96 h分别检测Caspase-3、9；Bax、Bcl-2、Nrf2蛋白的表达水平。结果 实验组原头蚴存活率随时间延长降低，在96 h降至为0%；两组原头蚴体内活性氧检测显示：实验组ROS水平明显提高，12 h最高，差异具有统计学意义（T=11.638， P<0.05），在72 h ROS水平与空白组相近；Western blot实验表明，凋亡蛋白Bax（T=4.997，P＜0.05）、Caspase-3蛋白（T=6.118，P＜0.05）、Caspase-9蛋白（T=3.435，P＜0.05），实验组的蛋白水平大于空白组，有统计学意义。抗凋亡蛋白Bcl-2，实验组的蛋白水平小于空白组，有统计学意义（T=9.184，P＜0.05），两组Nrf2蛋白水平差异无统计学意义（T=0.902，P=0.418）。结论 大肠埃希菌在体外可以快速致细粒棘球蚴死亡。0.5 mol·L-1大肠埃希菌在体外可以快速致细粒棘球蚴死亡，氧化应激通路可能参与了此过程。

关键词：细粒棘球蚴；大肠埃希菌；活性氧（ROS）；Bcl-2蛋白；Nrf2蛋白

中图分类号：中图分类号R532.32文献标志码：A文献标识码

In vitro study of the pathway associated with the death of Echinococcus granulosus by Escherichia coli

MIAO Zhang1，CHENG Xiao1，MAN Yang1，LIN  Zhiyi2，WU  Xiangwei2，WU  Xiya1，CAI  Kefeng1，CUI  Jie1，ZHANG  Hongwei2，3*

（1 School of Medicine， Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832008， China; 2 First Affiliated Hospital， School of

Medicine， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832008， China; 3 NHC Key Laboratory of Prevention and Treatment

of Central Asia High Incidence Disease，Shihezi，Xinjiang 832008， China）

Abstract：  Objective To study the changes in activity and morphology of Echinococcus granulosus under the conditions of co-culture with Escherichia coli in vitro， and some of the involved pathways.To study the changes in activity and morphology over time of Echinococcus granulosus co-cultured with specific concentrations of Escherichia coli in vitro， and some of the pathways involved. Methods The sheep-derived protozoa were resuspended and counted， divided into blank group and 0.5 maixa concentration Escherichia coli group （experimental group）， and stained with 0.1% eosin staining solution at a ratio of 1∶1 by volume for 2 min at 12， 24， 48， 72， 96 h as time points and then observed under microscope and calculated the survival rate of protozoa in both groups; the reactive oxygen species kit was used to detect the protozoa in both groups at the above time points The expression levels of Caspase-3 and 9， Bax， Bcl-2 and Nrf2 were measured at 12， 48， 96 h.Results The survival rate of protozoa in the experimental group decreased with time， and decreased to 0% at 96 h. The detection of reactive oxygen species in the two groups showed that the level of ROS in the experimental group increased significantly， with the highest level at 12 h. The difference was statistically significant （T=11.638， P<0.05）， and the level of ROS at 72 h was similar to that of the blank group. Western blot experiment showed that the protein levels of apoptotic protein Bax（T=4.997， P<0.05）， Caspase-3 protein （T=6.118， P<0.05）， Caspase-9 protein （T=3.435， P<0.05）， the protein levels in the experimental group were greater than those in the blank group， which was statistically significant. For anti-apoptotic protein Bcl-2， the protein level of the experimental group was smaller than that of the blank group， which was statistically significant （T=9.184， P<0.05）， and the difference in Nrf2 protein level between the two groups was not statistically significant （T=0.902， P=0.418）; Conclusion Escherichia coli can rapidly cause death of Echinococcus granulosus in vitro. Escherichia coli（0.5 mol·L-1） can rapidly cause death of Echinococcus granulosus in vitro， The oxidative stress pathway may be involved in this process.

Key words： Echinococcus granulosus; escherichia coli; ROS; Bcl-2 protein;  Nrf2 protein

细粒棘球蚴（CE）所致的囊性肝包虫病是一种世界范围内流行的人畜共患病［1-2］，通过大量的临床观察以及包虫影像学分型［3］依据肝两型包虫病诊断与治疗专家共识（2019版）［3］并通过大量的临床观察，我们认为，包虫可以走向自然死亡，胆瘘和感染是两大重要因素，很多合并细菌感染的包虫囊肿会发生脓肿样改变，可发生快速死亡，引起肝包虫囊内细菌感染的主要病原菌是大肠埃希菌［4］。本课题组实验证明大肠埃希菌在体外可以通过内质网通路导致原头蚴死亡，那么此过程是否有氧化应激、线粒体等死亡通路的参与，目前尚无确切证据，本研究延续前期实验［5］，使用最佳0.5麦氏浓度大肠埃希菌与细粒棘球蚴原头蚴体外共培养，连续观察原头蚴形态学及活性的变化，并探讨氧化应激通路是否参与其中，以期为进一步研究肝包虫的自然病程提供证据。

1 材料与方法

1.1 材料

细粒棘球蚴含细粒棘球蚴囊泡的羊肝购于新疆维吾尔自治区昌吉屠宰场；大肠埃希菌标准菌株（ATCC 25922）来源于石河子大学医学院第一附属医院微生物室。

1.2 主要试剂

磷酸盐缓冲液（PBS）、1640培养基、胎牛血清，伊红染液等购于美国Life Gibco公司；Caspase-3、Caspase-9、Bax、bcl-2、Nrf2蛋白抗体购于Boster公司。

1.3 方法

1.3.1 细粒棘球蚴原头蚴的收集培养

将新鲜包虫羊肝放于提前灭菌后的自来水中冲洗3遍，去除羊肝表面残留血渍及杂质，使用75%的酒精擦洗羊肝表面3次后抽取养肝囊泡内的囊液，并将囊液注入高压灭菌的玻璃试剂瓶中，将囊液移入超净操作台中，沉淀静置3 min后，去除上层囊液，再次加入PBS溶液后静置2 min，使用注射器去除上层液体，重复10次。将收集到的细粒棘球蚴移入15mL离心管中，加入PBS溶液的将总体积定容至10mL，混匀后抽取20μL加入同体积0.1%伊红染液，3 min后在显微镜下观察计算染色率。当染色率≤2%时可用于后续实验研究，如染色率大于2%，继续重悬、静置步骤。放入细胞培养箱中培养。每隔48h更换一次培养基并使用无菌PBS溶液清洗原头蚴，如培养基颜色变黄则根据实际情况更换培养基。原头蚴存活率（%）=（未染色原头蚴个数／原头蚴总和）×100%。

1.3.2 观察大肠埃希菌对体外培养细粒棘球蚴原头蚴活性的影响

在12、24、48、72、96h观察两组原头蚴形态及存活情况，具体如下：使用移液枪将两组观察时间点细粒棘球蚴移至15mL离心管，吹打混匀培养基，抽取100μL（约100个原头蚴）含原头蚴的培养液悬液至载玻片上，同体积伊红染液染色3 min，使用显微镜观察两组原头蚴活力变化、形态结构的变化。原头蚴在活力较好的时候，不会被伊红染液染色，当期活力差或已发生死亡的时候会被染成红色。在倒置显微镜下计算原头蚴染色个数和总个数。

1.3.3 活性氧測定

分别按照观察时间点从两组六孔板中移取适量原头蚴，放入离心管中使用PBS清洗重悬3次；将DCFH-DA与1640培养基按1∶1 000比例稀释，两组原头蚴分别设置阳性对照管和DCFH-DA管，DCFH-DA管内加入稀释后的DCFH-DA；阳性空白组内加入Rosup；分别将两组的阳性对照管、DCFH-DA管孵育30 min；调整离心机转速到1 000g，离心时间10 min，去除上层液体，使用PBS清洗重悬原头蚴3次；避光环境下使用荧光显微镜观察原头蚴ROS水平，拍摄荧光图片。

1.3.4 Western blot 检测Caspase-3、9、Bcl-2、Bax、Nrf2蛋白的表达水平

将两组六孔板中的原头蚴放入离心管，洗涤离心后加入蛋白裂解液RIPA∶PMSF=100∶1，冰上裂解20 min后使用超声粉碎仪提取蛋白；用金属浴将加入loading buffer的蛋白变性。按WB实验法依次完成电泳、电转、封闭、一抗孵育、二抗孵育、曝光。

1.4 统计学分析

计量资料以平均值±标准偏差（±S）表示；两组之间比较时用χ2检验，P<0.05时表示差异有统计学意义。应用SPSS 23.0软件作数据统计分析，ROS荧光图片、WB条带灰度采用Image J进行量化分析，Graphpad Prism 5作图。

2 结果

2.1 大肠埃希菌对体外细粒棘球蚴原头蚴形态的影响

不同时间点下，空白组原头蚴变化不明显，形态规则，呈椭圆形；随着时间的延长，实验组原头蚴呈外翻型，表面相对粗糙、皱缩、变形，边界不清晰，随时间延长被伊红染色的原头蚴个体数量逐渐增多，在96 h镜下原头蚴被全部染色（图1）。

2.2 大肠埃希菌对体外细粒棘球蚴原头蚴活力的影响

在大肠埃希菌作用12、24、48、72、96h，分别用0.1%伊红染色，计算原头蚴的存活率。空白组的存活率分别为99.80%±0.35%、98.59%±0.05%、98.22%±0.30%、97.72%±0.14%、96.96%±0.30%，实验组存活率分别为70.03%±1.39%、56.11%±2.94%、20.61%±3.44%、8.85%±1.95%、0，随着时间的延长，细粒棘球蚴原头蚴活性降低，大肠埃希菌对细粒棘球蚴致死作用显著增强（图2）。

2.3 大肠埃希菌对体外细粒棘球蚴原头蚴活性氧（ROS）的影响

采用DCFH-DA荧光探针检测不同时间两组原头蚴体内活性氧（ROS）浓度，并使用荧光显微镜观察并拍摄荧光图片。

结果显示空白组的原头蚴ROS浓度几乎无变化，与大肠埃希菌共培养的原头蚴体内ROS浓度在72 h前均高于空白组，在72 h两组ROS浓度近乎持平。在72 h后由于实验组原头蚴死亡ROS含量低于空白组。实验组ROS于12 h表达峰值，两组差异具有统计学意义（T=11.638， P<0.05）（图3，图4）。

2.4 大肠埃希菌对体外细粒棘球蚴原头蚴Caspase-3、9；Bax、Bcl-2、Nrf2蛋白水平的影响

由图5可知，在12、48、96h检测蛋白水平，与空白组相比，不同时间点内，凋亡蛋白Bax（T=4.997，P＜0.05）、Caspase-3（T=6.118，P＜0.05）、Caspase-9（T=3.435，P＜0.05），实验组的蛋白表达均高于对照组，具有统计学差异。实验组的抗凋亡蛋白Bcl-2（T=9.184，P＜0.05）表达水平明显低于对照组，具有统计学差异，实验组Nrf2蛋白（T=0.902，P=0.418）的表达水平在12 h高于对照组，但两组比较无统计学差异。

3 讨论

大肠埃希菌是无芽孢革兰阴性短杆菌，周身鞭毛，可运动，胃肠道内多见。其在正常栖居环境中不会致病，但当进入胆囊、膀胱会引起炎症。大肠埃希菌毒力因子包括内毒素、荚膜、黏附素和肠毒素等，是引起囊性肝包虫常见并发症囊内细菌感染的主要致病菌［6］。目前认为囊型肝包虫发生细菌感染与胆瘘紧密相关，且前期本中心术中证实部分囊型包虫内囊黄染，合并胆瘘［7］，有文献分析为包虫囊周围肝内胆管长时间受到压迫［8-9］，发生狭窄、扭曲，胆汁淤积外渗，虫囊与胆道相通，细菌随胆汁进入虫囊形成感染［10］。

课题组前期使用小鼠接种胆汁处理后的原头蚴模拟胆瘘的发生，实验发现包虫囊肿生长受到抑制［11］，后延续实验将胆汁与原头蚴体外共培养，发现胆汁并不能直接灭活原头蚴 ［12］，那么随胆汁进入囊内的大肠埃希菌能否直接杀死原头蚴？这一现象在体内很难进行单一因素观察，所以通过建立体外感染模型进行研究。结果表明大肠埃希菌可以降低体外细粒棘球蚴活性，同时活性氧（ROS）、部分凋亡蛋白参与了此过程。

ROS在细胞增殖和凋亡中起着至关重要的作用，适当较低的ROS水平可以作为第二信使促进细胞增殖，当机体内ROS水平过高时，抗氧化功能系统发生破坏［13-14］，迫使细胞处于氧化应激的环境中［15］，引起细胞损伤。有研究表明，细胞内过多ROS的产生，可以导致线粒体结构受损［16］，促使细胞凋亡。本次实验中，在大肠埃希菌的作用下，细粒棘球蚴体内ROS快速积聚，12h时达到顶峰，致使细粒棘球蚴存活率降低。提示大肠埃希菌可能通过提高ROS的水平，影响细粒棘球蚴的活性。

Nrf2可以调控抗氧化应激因子表达，从而对抗氧化损伤，但有文献报道，一些毒性药物可以增强氧化应激的发生，但Nrf2的表达却是降低的［17］。本次实验中，实验组和对照组各时间点Nrf2的表达并无统计学意义，但在第12 h，实验组Nrf2表达水平是略高于对照组的，针对这一现象，本实验尚不能明确原因，其中涉及因素仍需进一步实验去证实。

Caspase家族蛋白启动和执行的细胞凋亡是一种不可逆转的级联反应［18］，在Caspase家族中，Caspase-9可以通过内源性的途径激活Caspase-3，诱导细胞发生凋亡［19］。在机体内，抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax相互结合，Bcl-2/Bax的相对比值是调控凋亡的决定因素［20-21］。本实验中，实验组不同时间点Caspase-9、Caspase-3、Bax表达均显著升高，Bcl-2出现下调，表明大肠埃希菌感染细粒棘球蚴后，使Caspase-9发生同源活化，直接激活Caspase-3，导致细粒棘球蚴死亡，同时Bax表达增加，Bcl-2/Bax比值减小，促进细粒棘球蚴发生死亡。结合上述实验结果，我们可知大肠埃希菌在体外可以降低细粒棘球蚴的活性，原因可能是改变了其生存环境，同时氧化应激及线粒体通路部分相关蛋白参与了此过程。但具体哪些通路参与或者主要调节了此过程，这些都仍需更深一步研究。

此外在临床观察中发现，自然状态下，病程较长的囊型肝包虫内多有钙化发生，提示包虫活性降低，彭心宇教授认为这是机体产生的一种营养不良性钙化［22］。马志刚等［11］研究表明囊型肝包虫病囊肿分型从CL型向V型演变，胆瘘发生率增高，胆瘘可以引起囊内包虫活性转变。而囊内细菌感染与胆瘘紧密相关，因此包蟲活性的降低与胆瘘、囊内感染、囊壁钙化都有着一定的联系，但是囊内细菌感染、胆瘘与囊壁钙化之间有无因果关系需要继续研究，人体内包虫囊肿自然演变受多种因素影响，是一个复杂渐进的过程，囊内细菌感染只是包虫囊肿活性降低的一种因素，肝包虫的自然病程还需要我们更全面更深层次的研究。

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（责任编辑：编辑唐慧）

收稿日期：中文收稿日期2022-05-16

基金项目：国家自然科学基金项目（81860363）;中国医学科学院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（2020-PT330-003）

作者简介：苗章（1992—），男，硕士研究生，住院医师，专业方向为普通外科。

*通信作者：张宏伟（1983—），男，副教授，从事肝胆胰外科研究，e-mail：zhw0108@163.com。