基于生物信息学分析EDIL3基因在宫颈癌中的表达及临床意义

王慧娟　郭炳轩　宋树言　李杨杨　者湘漪　李洪涛　李冬妹　潘泽民

摘要：目的 探討表皮生长因子样重复序列和盘状蛋白I样结构域3（EDIL3基因）在宫颈癌中表达及其对宫颈癌细胞SiHa、HeLa迁移的作用。方法 运用GEPIA、UALCAN、OncoLnc数据库分析EDIL3 基因mRNA在宫颈癌组织中的表达水平、基因启动子甲基化状态和预后的意义；采用免疫组织化学染色、Western blot、qRT-PCR分别检测宫颈癌组织和细胞中EDIL3蛋白及EDIL3基因mRNA表达水平；构建EDIL3-pcDNA3.1过表达质粒，转染分为实验组（转染过表达EDIL3-pcDNA3.1质粒）和对照组NC（转染空质粒），transwell实验检测宫颈癌细胞SiHa、HeLa的迁移。结果 生物信息学数据库分析显示EDIL3 基因mRNA在宫颈癌组织中低表达并且存在启动子高甲基化（P＜0.05），在宫颈癌不同分期中EDIL3基因的表达无差异（P＞0.05），EDIL3高表达与宫颈癌患者不良预后相关（P＜0.05）；免疫组织化学染色、Western blot、qRT-PCR与数据库分析结果一致，在宫颈癌组织和细胞中EDIL3 基因均低表达（P＜0.05），且其表达水平与 HPV感染无明显相关性（P＞0.05）；Transwell实验显示过表达EDIL3后增强宫颈癌细胞SiHa、HeLa的迁移能力 （P＜0.05）。结论 EDIL3 基因在宫颈癌组织和细胞中低表达并不受HPV感染的影响，而EDIL3高表达影响患者预后且促进宫颈癌细胞 SiHa 、HeLa的迁移能力。

关键词：宫颈癌；EDIL3基因；HPV；迁移

中图分类号：中图分类号R737.33文献标志码：A文献标识码

Expression and clinical significance of EDIL3 gene in cervical cancer based

on bioinformatics analysis

WANG Huijuan GUO  Bingxuan2，SONG  Shuyan2，LI Yangyang2，ZHE  Xiangyi2，3，LI  Hongtao3，LI  Dongmei2，PAN  Zemin2*

（1 Department of Laboratory Medicine， The First Affiliated Hospital of School of Medicine， Shihezi University， Shihezi，

Xinjiang 832008， China; 2 Department of Biochemistry and Molecular Biology， School of Medicine， Shihezi University/Key

Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases Shihezi， Xinjiang 832002， China; 3 Department of Anatomy and Histology

and Embryology， School of Medicine， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832002， China）

Abstract：  Objective To investigate the expression of epidermal growth factor-like repeat and discoid protein i-like domain 3（EDIL3 gene） in cervical cancer and its effects on the migration of cervical cancer cells SiHa and HeLa. Methods GEPIA， UALCAN and OncoLnc databases were used to analyze the expression level， methylation status of gene promoter and prognostic significance of EDIL3 mRNA in cervical cancer. Immunohistochemical staining， Western blot and qRT-PCR were used to detect the expression levels of EDIL3 protein and EDIL3 mRNA in cervical cancer tissues and cells， respectively. Overexpression plasmid of EDIL3-pcDNA3.1 was designed and divided into experimental group （transfected with EDIL3 plasmid） and control group NC （transfected with empty plasmid）. transwell experiment was used to detect the migration of cervical cancer cells SiHa and HeLa. Results Bioinformatics database analysis showed that EDIL3 gene mRNA was low expressed and the promoter was hypermethylated in cervical cancer tissues （P<0.05）， and there was no difference in expression among different stages of cervical cancer （P > 0.05）. High EDI13 expression was associated with poor prognosis of cervical cancer patients （P<0.05）. The results of immunohistochemistry， Western blot and qRT-PCR were consistent with those of database analysis. The expression level of EDIL3 gene in both tissues and cells of cervical cancer was low （P<0.05）， and there was no significant correlation between its expression level and HPV infection （P > 0.05）. Transwell experiment showed that the overexpression of EDIL3 gene enhanced the migration capacity of cervical cancer cells SiHa and HeLa （P<0.05）. Conclusion The low expression of EDI13 gene in cervical cancer tissues and cells is not affected by HPV infection， while the high expression of EDI13 affects the prognosis of patients and promotes the migration ability of cervical cancer cells SiHa and HeLa.

Key words： Cervical cancer;EDIL3 gene;HPV;Migration

宫颈癌是一种在临床中非常常见的女性生殖道癌症，也是不发达国家和地区因癌症而死亡的最常见的原因之一［1］。刚刚发布的《2020年世界癌症报告》分析了中国癌症病例的变化和特点，新增宫颈癌患者60万例，因宫颈癌病死34万例［2］。研究发现宫颈癌发生的重要原因包括高危型人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）持续性感染，如HPV16、HPV18和HPV52，虽然针对高危型HPV研发了疫苗，但接种疫苗的人员并没有普及，特别是一些不发达地区的女性［3］。现如今临床治疗宫颈癌主要采用免疫和手术等综合治疗方法，但很大一部分患者生存率依然很低，因此迫切需要探索诊治宫颈癌的新策略、新方向和新靶点。

表皮生长因子样重复序列和盘状蛋白I样结构域3（epidermal growth factor-like repeats and discoidin I-like domains EDIL3）又称为发育内皮基因座-1（developmental endothelial locus-1，Del-1），位于人染色体5q14，3，分子量为52 kDa，全长约6 500 bp，EDIL3是一种细胞外基质蛋白，早期在小鼠胚胎中发现，亦是一种由胚胎内皮细胞分泌的糖蛋白。EDIL3编码的蛋白质是整合素配体，通过与整合素αvβ5相互作用促进新血管的生长［4］。EDIL3在结直肠癌［5］和肺腺癌［6］中表达下调，相反，其在乳腺癌［7］、胰腺癌［8］中表达水平增加，并与疾病预后不良相关。

至今为止，尚未见EDIL3基因在宫颈癌中作用研究的相关报道，因此本研究探讨EDIL3基因在宫颈癌中的表达情况及临床意义，旨在为宫颈癌的预防和诊治提供有价值的基础研究和临床指标。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

实验选取购自武汉普诺赛生命科技公司的宫颈癌细胞株SiHa、HeLa和人宫颈上皮永生化细胞株HaCaT作为研究对象。实验所用试剂有美国Gibco 公司生产的培养基（DMEM）和胎牛血清（FBS）;北京中山金桥公司生产GAPDH鼠单克隆抗体;美国Promege公司生产的Lipofectamine 2000转染试剂;兔单克隆抗体EDIL3购自武汉三鹰生物技术有限公司;Transwell小室购自美国Corning公司;EDIL3-pcDNA3.1过表达质粒由上海吉玛制药技术有限公司合成。

1.2 数据来源

1.2.1 GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）数据库

GEPIA在线应用数据库（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#index）是北京大學各级专家精心研制开发的一款软件，目前已更新到2.0版本。

该数据库含有TCGA和GTEx 2个数据库中正常组织样本8 587个和肿瘤样本9 736个，在正常组织和肿瘤组织中用以分析某基因的表达差异性、预后及相关性等。该在线工具在本研究中主要挖掘EDIL3在宫颈癌及正常宫颈组织中的ｍRNA表达差异。筛选条件如下： Expression Analysis： Expression DIY； Box Plot， Gene：EDIL3， Cancer name： CESC； Plot， 其余条件不变；Stage Plot分析宫颈癌不同分期中的基因表达。

1.2.2 UALCAN数据库

UALCAN数据库（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）主要建立在肿瘤基因组图谱 TCGA数据库的基础上用于对某基因的表达谱、启动子甲基化情况、biomarker鉴定、相关性、泛癌表达及预后等相关癌症数据进行分析。

本研究应用该数据库对EDIL3基因启动子甲基化状态进行了分析。筛选条件如下： TCGA Gene analysis： ”EDIL3”，” Cervical squamous cell carcinoma”；Methylation： ”Sample types”。

1.2.3 OncoLnc数据库

OncoLnc数据库（www.oncolnc.org）包括了TCGA数据库中8647个病人的21种肿瘤的临床信息、生存信息及对应的mRNA和miRNA的表达谱数据和来源于MiTranscriptome项目中lncRNA的表达谱数据，因此该数据库囊括了mRNA、miRNA和lncRNA 3种转录本的生存分析，使用户探索研究肿瘤中和生存分析相关的基因更加便利。筛选条件如下： Gene：EDIL3，Submit;选择宫颈癌（CESC），点击Yes Please提交；在新弹出的页面中定义Cutoff值（一般用中位数定义分组，即50%），Submit后就能看到KM生存图和P值了;点击Click Here下载Excel格式的原始数据，使用X-tile软件计算Ｐ<0.05时的Cutoff值，重新分析结果。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

复苏液氮中冻存的细胞后将SiHa、HeLa细胞培养于含10%的FBS和1%的双抗（青、链霉素）的DMEM中，HaCaT细胞培养于含15% 的FBS和1%的双抗的DMEM中，细胞培养箱条件为5% CO2、37℃。用胰蛋白酶消化对数期的细胞3 min并1∶3传代，连续传三代后进行后面的实验。

1.3.2 细胞转染

取180uL SiHa细胞铺板， 培养24h弃去6孔板中培养基后用1×PBS洗涤两遍，加入800 μL DMEM备用。配置A 液：100 μL DMEM+2 μg EDIL3过表达质粒；B液：100 μL DMEM+2 μg空质粒NC；C液2份：100 μL DMEM +5 μL Lipofectamine2000，静置5 min后，将Ａ液与一份Ｃ液混匀，Ｂ液与另一份Ｃ液混匀后共同静置20 min不要移动，然后将混合液A+C和B+C分别散在均匀滴入上面备用6孔板细胞中，4～6 h后换完全培养基，24h后进行细胞计数铺板。HeLa细胞转染步骤同上。

1.3.3 qRT-PCR实验检测细胞中EDIL3基因 mRNA的表达水平

将处于对数期状态的细胞使用TRIzol提取总RNA，然后把提取到的RNA逆转录为cDNA放入低温冰箱备用。以2 μL cDNA为模板进行扩增（预变性90℃ 30s，95℃ 3s，60℃ 30s，40个循环）。使用实验室22331 Hamburg型 PCR仪自带软件分析及获取循环阈值ＣＴ，最后使用公式2-△△CT计算细胞mRNA的相对表达量。

1.3.4 Western blot 實验检测细胞中EDIL3蛋白质的表达水平

在处于对数生长期的细胞皿中加入RIPA+1%PMSF裂解液放入冰箱裂解20 min，待细胞呈流沙状态完全裂解后用刮刀将全部细胞刮入EP管中备用，12 000 r·min-1，4 ℃离心15min。吸取部分蛋白按4∶1比例加入5×Loading Buffer后煮沸（100 ℃，10 min）放入冰箱冰冻储存，剩余20 μL使用BCA试剂测定其浓度。用SDS-PAGE （80 V 30min后110 V 1h）分离20 mg蛋白后湿转（110 V，60min）至PVDF膜上，加入雀巢脱脂奶粉封闭（5%，常温，2h）后孵育一抗（1∶1 000，4℃）过夜杂交，TBST洗涤3次后孵育二抗（1∶5 000，室温，2h）。TBST洗涤3次后由Protein-Simple公司的Fluorchen HD2化学发光仪曝光条带及使用ImageJ软件测定各条带灰度值。目的蛋白质的相对表达量=目的蛋白质条带灰度值/内参GAPDH蛋白质条带灰度值。

1.3.5 免疫组织化学方法检测组织中EDIL3蛋白质表达水平

选取本校第一附属医院收治的宫颈癌患者石蜡包埋的组织样本72例及炎症患者石蜡包埋的组织样本36例，实验获得医院伦理委员会的批准及患者的知情同意。使用第二代杂交俘获 （hybrid capture system-2，HC-2） 技术检测所收集诊断为宫颈癌疾病的样本的 HPV感染的情况，所有组织样本严格按照免疫组织化学染色实验操作步骤进行染色。EDIL3抗体浓度为1∶3 200。使用半定量计分法判断EDIL3阳性表达：阳性细胞数大于75%为4分，51%～75%为3分，26%～50%为2分，6%～25%为1分，小于5%为0分﹔在高倍镜视野下根据显色强度判断阳性强度：棕褐色为3分，棕黄色为2分，黄色为1分，无阳性细胞为0分。求取上述两项得分乘积：0分为阴性（－），1～2分为弱阳性（+），3～4分为中阳性（++），5～7分为强阳性（+++）。本实验取阴性和弱阳性归一为阴性，中阳性和强阳性归一为阳性，结果由医院病理科两名副主任医师以上以双盲法独立确定。

1.3.6 Transwell体外实验检测SiHa、HeLa 细胞迁移能力

取两组SiHa细胞（过表达EDIL3组和对照组NC），用胰蛋白酶消化后离心弃上清液使用PBS清洗1遍，加入无血清DMEM制成细胞悬液进行计数以调整细胞浓度为1×105 mL-1，24孔板中每孔加入含15% FBS总量为600 μl的 DMEM，用镊子轻轻将Transwell小室放入培养基中（避免产生气泡），吸取200 μL配置好的悬液梅花式点入 Transwell小室的上室，不要摇动放入条件为 37 ℃、5% CO2的 培养箱进行培养。36h后用1mL PBS分别清洗小室的上、下室两次后使用40 g·L-1多聚甲醛固定 半小时及0.1%的结晶紫室温孵育半小时，最后用清水轻柔洗涤3遍后使用干净棉签轻轻擦去小室内未迁移的细胞，在显微镜下随机拍9个高倍镜视野进行计数。HeLa 细胞迁移实验同上。

1.3.7 统计学方法

本次研究所有数据均重复实验3次并使用统计学软件SPSS 17.0进行分析，计量实验数据以X-±S表示。采用t检验比较两组实验结果的差异，卡方检验用于石蜡切片免疫组织化学结果分析，Spearman相关系数检验分析两者的相关性，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 生物信息学数据库预测宫颈癌组织中EDIL3基因 mRNA表达水平

根据GEPIA数据库预测EDIL3 基因mRNA在宫颈癌组织中的表达水平，结果显示与正常宫颈组织相比较，EDIL3基因 mRNA在宫颈癌组织中低表达（P<0.05），在宫颈癌不同分期中的基因表达无差异（P>0.05）（图1）。

2.2 生物信息学数据库分析宫颈癌组织中EDIL3基因启动子甲基化状态

使用UALCAN数据库预测EDIL3基因启动子甲基化在宫颈癌组织中的水平，结果显示EDIL3基因启动子在宫颈癌组织中高甲基化，P=1.62E-12，差异具有统计学意义（P<0.05）（图2）。

2.3 生物信息学数据库分析EDIL3基因表达水平与宫颈癌预后的关系

OncoLnc数据库选取患宫颈癌疾病263例病人分析其预后，其中126例患者EDIL3高表达和 137例患者EDIL3低表达。结果显示EDIL3高表达的宫颈癌患者生存率较低表达的宫颈癌患者低，预后不良，（P<0.05）（图3）。

2.4 免疫组织化学分析EDIL3在宫颈癌组织中的表达水平

采用免疫组织化学分析宫颈组织样本中EDIL3蛋白质表达水平，检测到EDIL3定位在细胞质中（图4）。染色结果统计显示与正常宫颈组织相比，EDIL3在宫颈癌组织中低表达（P<0.05）（表1）。

2.5 蛋白质印迹法和实时荧光定量PCR分析EDIL3在宫颈癌细胞中的表达水平

采用Western blot和qRT-PCR分别对宫颈细胞中EDIL3蛋白质和mRNA表达水平进行分析。统计结果显示EDIL3蛋白质和mRNA的表达水平在SiHa、HeLa中相对HaCaT较低（P<0.05）（图5）。

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（责任编辑：编辑唐慧）

收稿日期：中文收稿日期2022-10-13

基金项目：国家自然科学基金项目（82060518，U1503125）;新疆生产建设兵团国际科技合作计划基金项目（2019BC007）;石河子大學科研基金项目（ZZZC2021107）

作者简介：王慧娟（1986—），女，硕士研究生，主管技师，专业方向为人体重要功能蛋白的克隆与基因工程。

*通信作者： 潘泽民（1966—），男，教授，博士生导师， 从事人体重要功能蛋白的克隆与基因工程的研究，e-mail：panteacher89@sina.com。